Kluczowa różnica – północne, południowe i zachodnie plamy
Wykrywanie określonych sekwencji DNA, RNA i białek jest niezbędne w różnego rodzaju badaniach w biologii molekularnej. Elektroforeza żelowa to technika, która oddziela DNA, RNA i białka według ich wielkości. Z profili żelowych, konkretna sekwencja DNA, sekwencja RNA lub białko są wykrywane za pomocą specjalnych technik zwanych blottingiem i hybrydyzacją ze znakowanymi sondami. Istnieją trzy różne typy metod blottingu: południowa, północna i zachodnia. Kluczowa różnica między blottingiem Northern Southern i Western polega na typie cząsteczki wykrywanej w próbce. Southern blot to metoda, która wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA. Northern blot to technika, która wykrywa specyficzną sekwencję RNA z próbki RNA. Western blot to metoda, która wykrywa określone białko w próbce białka.
Co to jest Southern Blotting?
Technika Southern blotting została opracowana przez E. M. Southern w 1975 roku w celu identyfikacji określonej sekwencji DNA z próbki DNA. Jest to pierwsza technika blottingu wprowadzona do biologii molekularnej. Umożliwiło wykrycie określonych genów w DNA, określonych fragmentów DNA itp. Technika Southern blotting obejmuje kilka etapów. Są one następujące.
- DNA jest izolowane z próbki i trawione endonukleazami restrykcyjnymi.
- Przetrawiona próbka jest oddzielana przez elektroforezę w żelu agarozowym.
- Fragmenty DNA w żelu są denaturowane w pojedyncze nici przy użyciu roztworu alkalicznego.
- Pojedyncza nić DNA jest przenoszona na nitrocelulozową membranę filtracyjną przez transfer kapilarny.
- Przeniesione DNA jest trwale przymocowane do membrany.
- DNA utrwalone na membranie jest hybrydyzowane ze znakowanymi sondami.
- Niezwiązane DNA jest wypłukiwane z membrany przez płukanie.
- Film rentgenowski jest eksponowany na błonę i przygotowywany jest autoradiograf.
Southern blotting jest stosowany w różnych aspektach biologii molekularnej. Jest przydatny w mapowaniu RFLP, badaniach kryminalistycznych, metylacji DNA w ekspresji genów, wykrywaniu zmutowanych genów w zaburzeniach genetycznych, tworzeniu odcisków palców DNA itp.
Rysunek 01: Technika Southern Blotting
Co to jest Northern Blotting?
Northern blotting to metoda przeznaczona do wykrywania określonej sekwencji RNA lub sekwencji mRNA z próbki w celu zbadania ekspresji genów. Ta technika została opracowana przez Alwine'a, Kempa i Starka w 1979 roku. Różni się od technik sourthern i western blottingiem kilkoma etapami. Jednak ta technika jest również wykonywana poprzez elektroforezę żelową, blotting i hybrydyzację ze specyficznymi znakowanymi sondami i detekcję. Technikę Northern blotting wykonuje się w następujący sposób.
- RNA jest ekstrahowane z próbki i rozdzielane przez elektroforezę żelową.
- RNA jest przenoszone z żelu na membranę do blottingu i utrwalane.
- Błona jest traktowana znakowaną sondą przygotowaną z cDNA lub RNA (sonda jest komplementarna do określonej sekwencji w próbce).
- Sonda jest inkubowana z membraną, aby związać się z określoną sekwencją.
- Niezwiązane sondy są wypłukiwane.
- Hybrydyzowane fragmenty są wykrywane przez autoradiograf.
Northern blotting jest ważnym narzędziem w wykrywaniu i oznaczaniu ilościowym zhybrydyzowanego mRNA, badaniu degradacji RNA, ocenie okresu półtrwania RNA, wykrywaniu splicingu RNA, badaniu ekspresji genów itp.
Rysunek 02: Northern Blotting
Co to jest Western Blotting?
Western blotting to metoda wykrywania określonego białka z mieszaniny białek za pomocą znakowanego przeciwciała. Dlatego western blot jest również znany jako immunoblot. Ta technika została wprowadzona przez Towbina i wsp. w 1979 roku i obecnie jest rutynowo wykonywana w laboratoriach do analizy białek. Kroki są następujące.
- Białka są ekstrahowane z próbki
- Białka są rozdzielane według ich rozmiarów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym
- Oddzielone cząsteczki są przenoszone na membranę PVDF lub membranę nitrocelulozową przez elektroporację
- Błona jest zablokowana dla niespecyficznego wiązania z przeciwciałami
- Transferowane białka są wiązane z przeciwciałami pierwszorzędowymi (przeciwciała znakowane enzymami).
- Membrana jest płukana w celu usunięcia niespecyficznie związanych przeciwciał pierwotnych
- Związane przeciwciała są wykrywane przez dodanie substratu i wykrycie utworzonego kolorowego osadu
Western blotting jest użyteczny w wykrywaniu przeciwciał anty-HIV w próbce ludzkiej surowicy. Western blot może być również stosowany jako test potwierdzający zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B i test ostateczny na chorobę szalonych krów.
Rysunek 03: Western blot
Jaka jest różnica między Northern Southern a Western Blotting?
Północne kontra Południowe kontra Zachodnie |
|
| Typ wykrytej cząsteczki | |
| Northern Blotting | Northern blotting wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA. |
| Western Blotting | Western blotting wykrywa określone białko w próbce białka. |
| Rodzaj żelu | |
| Northern Blotting | Wykorzystuje żel agarozowy/formaldehydowy. |
| Southern Blotting | To używa żelu agarozowego. |
| Western Blotting | Wykorzystuje żel poliakrylamidowy. |
| Metoda bibuły | |
| Northern Blotting | To jest transfer kapilarny. |
| Southern Blotting | To jest transfer kapilarny. |
| Western Blotting | To jest przelew elektryczny. |
| Wykorzystane sondy | |
| Northern Blotting | Sondy cDNA lub RNA znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie. |
| Southern Blotting | Sondy DNA są oznakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie. |
| Western Blotting | Pierwotne przeciwciała są używane jako sondy. |
| System wykrywania | |
| Northern Blotting | Odbywa się to za pomocą autoradiografu lub wykrywania zmiany światła lub koloru. |
| Southern Blotting | Odbywa się to za pomocą autoradiografu, wykrywania światła lub zmiany koloru. |
| Western Blotting | Odbywa się to za pomocą wykrywania światła lub zmiany koloru. |
Podsumowanie – Północne kontra Południowe kontra Zachodnie
Blotting to specjalna technika opracowana do identyfikacji określonego DNA, RNA lub białka z próbek. Istnieją trzy oddzielne procedury blottingu, a mianowicie północna, południowa i zachodnia, w celu wykrycia określonego typu cząsteczki. Technika Northern blotting jest przeznaczona do wykrywania określonej sekwencji RNA z mieszaniny RNA. Technika Southern blotting umożliwia wykrycie określonej sekwencji DNA z próbki DNA, a technika Western blotting została opracowana w celu identyfikacji konkretnego białka z mieszaniny białek.
