Kluczowa różnica między starterami losowymi a oligo dT polega na tym, że starter losowy jest mieszaniną wszystkich możliwych sekwencji oligonukleotydów heksamerowych, podczas gdy starter oligo dT składa się z jednoniciowego odcinka 12–18 dezoksytymidyn.
Odwrotna transkrypcja to mechanizm, w którym cDNA może być syntetyzowany przy użyciu mRNA lub dowolnego gatunku RNA. W celu wytworzenia cDNA należy dostarczyć enzym odwrotnej transkryptazy i inne niezbędne składniki, zwłaszcza matrycę i startery. Startery to krótkie sekwencje DNA specjalnie zaprojektowane do amplifikacji sekwencji docelowych. Startery losowe i startery oligo dT to dwa popularne typy starterów stosowanych w odwrotnej transkrypcji. Dlatego starter losowy lub starter oligo dT to krótkie sekwencje oligonukleotydowe DNA wymagane do odwrotnej transkryptazy do zainicjowania odwrotnej transkrypcji. W zależności od matrycy RNA, odpowiedni starter może być wybrany spośród tych dwóch typów starterów.
Co to są startery losowe?
Losowy starter to mieszanina oligonukleotydów reprezentujących wszystkie możliwe sekwencje heksamerowe. Sekwencja starterów losowego startera to 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T lub C. Dlatego startery losowe mogą być stosowane do amplifikacji jednoniciowego DNA lub RNA przez polimerazę DNA lub odwrotną transkryptazę, odpowiednio. Poza tym losowa mieszanina starterów jest zdolna do amplifikacji wszystkich regionów RNA w celu wygenerowania cDNA. W ten sposób wytwarza różne długości cDNA.
Rysunek 01: Losowe startery
Co najważniejsze, losowa mieszanina starterów nie wykazuje specyficzności względem matrycy. Nie jest w stanie odróżnić mRNA i innych rodzajów RNA. I hybrydyzuje z dowolnym gatunkiem RNA w próbce. Jednak losowa mieszanina starterów jest odpowiednia do odwrotnej transkrypcji RNA bez ogonków poli(A), takich jak rRNA, tRNA, niekodujące RNA, małe RNA, prokariotyczny mRNA itp., zdegradowany RNA i RNA o znanych strukturach drugorzędowych.
Co to jest Oligo dT?
Podkład Oligo dT to odcinek 12 – 18 dezoksytyminy (dT). Sekwencja startera może być przedstawiona jako 5'-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Służy do produkcji cDNA z mRNA zawierającego ogon poli(A). Zasadniczo działa jako starter do reakcji katalizowanej przez odwrotną transkryptazę. Podczas odwrotnej transkrypcji, startery oligo dT przyłączają się z poliadenylowanym ogonem znajdującym się na końcu 3´ większości eukariotycznych mRNA i rozpoczynają proces.
Rysunek 02: Odwrotna transkrypcja przy użyciu Oligo dT Primer
W przeciwieństwie do startera losowego, starter oligo dT nie jest odpowiedni dla zdegradowanego RNA lub RNA bez ogonków poli(A), w tym prokariotycznego RNA i mikroRNA.
Jakie są podobieństwa między losowymi starterami a Oligo dT?
- Starter losowy i starter oligo dT to dwa typy starterów, które są używane w odwrotnej transkrypcji i tworzeniu cDNA.
- Użycie losowego startera i startera oligo dT razem zwiększa czułość syntezy cDNA.
- Są to jednoniciowe krótkie sekwencje nukleotydowe.
Jaka jest różnica między losowymi starterami a Oligo dT?
Losowy starter to krótka sekwencja oligonukleotydowa złożona z sekwencji losowej. Tymczasem starter oligo dT to krótka nić złożona z 12 do 18 dezoksytymidyn. To jest więc kluczowa różnica między starterami losowymi a oligo dT. Sekwencja losowego startera to 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T lub C. Natomiast sekwencja startera oligo dT to 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´. Dlatego możemy uznać to za kolejną różnicę między losowymi starterami a oligo dT.
Ponadto, losowe startery nie wykazują specyficzności względem matrycy i hybrydyzują z dowolnym gatunkiem RNA, podczas gdy startery oligo dT wykazują specyficzność względem ogonów poli(A) eukariotycznego mRNA.
Poniższa infografika podsumowuje różnicę między starterami losowymi a oligo dT.
Podsumowanie – Losowe startery kontra Oligo dT
Starter losowy i starter oligo dT to dwa typy starterów stosowanych w syntezie cDNA. Starter losowy składa się z mieszaniny oligonukleotydów, reprezentujących wszystkie możliwe sekwencje heksamerowe, podczas gdy starter oligo dT jest sekwencją jednoniciową złożoną z 12 do 18 dezoksytymidyn. To jest więc kluczowa różnica między starterami losowymi a oligo dT. Poza tym startery oligo dT są przydatne do pełnej długości odwrotnej transkrypcji RNA z ogonem poli(A), podczas gdy startery losowe są przydatne do odwrotnej transkrypcji większości gatunków RNA, w tym RNA zdegradowanego, RNA bez ogonków poli(A) i RNA zawierającego struktury drugorzędowe. Dlatego też losowy starter nie wykazuje specyficzności względem matrycy, podczas gdy starter oligo dT wykazuje specyficzność wobec eukariotycznego mRNA zawierającego ogon poli(A).
