Kluczowa różnica – startery do PCR a startery do sekwencjonowania
Wraz z ostatnimi osiągnięciami w dziedzinie biologii molekularnej opracowano różne techniki genetyczne, które sprawiły, że procesy badawcze na różnych drogach badanego obiektu były łatwe i dokładne. PCR i inne procedury sekwencjonowania to dwie ważne takie techniki. Używają różnych podkomponentów. Startery są uważane za główny podskładnik wspólny dla technik PCR i sekwencjonowania. Startery PCR stosuje się do amplifikacji określonej sekwencji DNA, podczas gdy startery do sekwencjonowania są stosowane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA z zamiarem ujawnienia jego specyficznej kolejności sekwencji nukleotydowej. Jest to kluczowa różnica między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania.
Co to są startery PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika genetyczna wykorzystywana w dziedzinie biologii molekularnej w celu amplifikacji jednej lub kilku kopii określonego segmentu DNA i uzyskania wielu milionów identycznych kopii. W reakcji PCR stosuje się różne składniki, w tym startery. Startery są krótkimi nićmi DNA o długości 18-25 nukleotydów, dzięki czemu są kompatybilne z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. Startery mogą być starterem przednim i starterem wstecznym. Startery te wiążą się z fragmentem DNA w określonych punktach, w których polimeraza DNA wiąże się ze specyficznym starterem w danej lokalizacji i inicjuje syntezę nowej nici DNA.
Dobór starterów jest ważnym aspektem procesu PCR. Ważny jest dobór długości podkładu. Idealna długość to 18-25 nukleotydów. Jeśli długość jest zbyt krótka lub zbyt długa, startery nie będą wiązać się z sekwencją DNA, która ma być dokładnie amplifikowana. Startery, które są zbyt krótkie, prowadzą do niespecyficznego przyłączania starterów w różnych miejscach sekwencji DNA.
Rysunek 01: Startery PCR
Zawartość guaniny i cytozyny (GC) w dobrym starterze powinna mieścić się w zakresie 40-60. Temperatura wygrzewania startera i temperatura topnienia są istotnymi czynnikami podczas PCR. Temperatura topnienia powinna być dokładnie obliczona, a temperatura wyżarzania gruntu powinna być o 5 0C niższa niż temperatura topnienia. Temperatura topnienia powinna wynosić 60 °C i 75 °C. Zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura spowoduje mniejszą aktywność polimerazy DNA.
Co to są startery sekwencjonowania?
Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA z zamiarem ujawnienia jego specyficznej tożsamości. Aby uzyskać dobre wyniki sekwencjonowania, ważne są wysokiej jakości startery i matryce. Tak więc, gdy wybiera się startery, powinny one być unikalne dla konkretnego regionu, w którym chcemy sekwencjonować. Powinna również mieć prawidłową orientację, gdzie sekwencje są zwykle generowane od 3' do 5' końców starterów. Sekwencja powinna być pozbawiona niepożądanej samohybrydyzacji, takiej jak tworzenie pętli spinki do włosów. Nie powinien zawierać kolejnych formacji zasad guaninowych.
Temperatura topnienia (Tm) podkładu musi być odpowiednia do warunków sekwencjonowania. Dlatego powinien mieścić się między 52oC a 74oC. Preparat oligonukleotydów do zastosowania jako starter powinien zostać oczyszczony w celu uzyskania pożądanej sekwencji o pełnej długości. Jeśli oligonukleotydy zawierają zanieczyszczenia, sygnalizacja sekwencji starterów będzie nałożona z różnych miejsc starterów, a także zmniejszy się liczba komórek zasadowych.
Rysunek 02: Startery do sekwencjonowania
Temperatura topnienia startera (Tm) oligonukleotydu określa, jak silnie komplementarne nici DNA są ze sobą hybrydyzowane. Tm można uznać za obliczenia termodynamiczne, w których jest ona zależna zarówno od sekwencji DNA, jak i kilku warunków, takich jak stężenie soli. Tm jest ważna podczas PCR, gdzie wariant zwany sekwencjonowaniem cyklicznym jest używany do wytworzenia grupy fragmentów zakończonych dideoksynukleotydami. Tutaj starter, który jest sekwencjonowany, będzie początkowo alternatywnie łączony, następnie wydłużany i na końcu denaturowany w celu amplifikacji. Dlatego wartość Tm powinna mieścić się w zakresie od 52oC do 74o C. Zsyntetyzowane oligonukleotydy można uzyskać z laboratoriów syntezy DNA/RNA zgodnie z wybór. Synteza na małą skalę wykorzystywana do sekwencjonowania DNA wynosi zwykle 50 nmol. Co najważniejsze, startery używane do sekwencjonowania powinny być oczyszczone, aby były wolne od zanieczyszczeń, które zapobiegną pogorszeniu jakości.
Jakie są podobieństwa między starterami PCR a starterami sekwencjonowania?
- Zarówno startery do PCR, jak i startery do sekwencjonowania są starterami używanymi w procesie amplifikacji docelowej sekwencji DNA.
- Zarówno startery do PCR, jak i startery do sekwencjonowania składają się z nukleotydów.
- Zarówno startery do PCR, jak i startery do sekwencjonowania są krótkimi oligomerami.
Jaka jest różnica między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania?
Podkłady PCR a podkłady do sekwencjonowania |
|
| Startery PCR to krótkie nici DNA o długości sekwencji nukleotydowej 18-25, dzięki czemu są kompatybilne z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. | Startery do sekwencjonowania to krótkie oligomery, które są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego specyficznej tożsamości. |
| Funkcja | |
| Startery PCR są używane do amplifikacji określonej sekwencji DNA. | Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA z zamiarem ujawnienia jego specyficznej tożsamości. |
| Liczba potrzebnych podkładów | |
| Dwa podkłady; jeden starter przedni i jeden starter wsteczny są używane jako startery PCR. | Potrzebujesz tylko jednego startera jako startera do sekwencjonowania. |
Podsumowanie – startery do PCR a startery do sekwencjonowania
Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA z zamiarem ujawnienia jego specyficznej tożsamości. Do uruchomienia procesu wystarczy jeden starter do sekwencjonowania. Aby uzyskać dobre wyniki sekwencjonowania, ważne są wysokiej jakości startery i matryce. Tak więc, gdy wybiera się startery, powinny one być unikalne dla konkretnego regionu, w którym chcemy sekwencjonować. Startery PCR to krótkie nici DNA o długości nukleotydów 18-25, które są kompatybilne z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. Startery PCR mogą być starterami do przodu i do tyłu. Zawartość guaniny i cytozyny (GC) w dobrym starterze powinna mieścić się w zakresie 40-60. Temperatura przyłączania startera i temperatura topnienia są istotnymi aspektami podczas PCR. To jest różnica między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania.
