PCR a PCR w czasie rzeczywistym
PCR lub reakcja łańcuchowa polimerazy to zrewolucjonizowane odkrycie we współczesnej biologii molekularnej, po raz pierwszy opracowane przez chemika Kary Mullisa w 1983 roku. Pozwala na amplifikację pojedynczej sekwencji złożonego DNA do analizy. Podstawową ideą PCR jest to, że dwa startery, które są komplementarne do przeciwnych nici sekwencji DNA, są zorientowane względem siebie; startery wytwarzają komplementarne nici, z których każda zawiera inny starter. Stąd wynikiem jest duża ilość sekwencji odpowiadającej DNA znajdującemu się pomiędzy dwoma starterami. Enzym polimerazy DNA służy do wydłużania starterów w reakcji PCR. Polimeraza DNA jest enzymem termostabilnym i ma zdolność przetrwania w wysokich temperaturach (94 do 95 °C) stosowanych do denaturacji matrycy DNA.
PCR składa się z trzech etapów, a mianowicie powtarzających się rund denaturacji, przyłączania starterów i syntezy DNA. Do przeprowadzenia tej reakcji służy termocykler, dzięki czemu można go zaprogramować na szybką i dokładną zmianę temperatury. Zastosowania PCR to śledztwa kryminalne, odcisk palca DNA, wykrywanie patogenów i analiza DNA wczesnych gatunków ludzkich.
Co to jest konwencjonalny PCR?
Istnieją trzy główne etapy konwencjonalnego PCR, a mianowicie; Etap amplifikacji DNA, rozdział PCR i detekcja produktów. Separacji segmentów DNA dokonuje się zazwyczaj za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Produkty są następnie barwione bromkiem etheiduim. Wreszcie wykrywanie osiąga się poprzez wizualizację prążków na żelach w świetle UV. Dlatego ostateczne wyniki konwencjonalnej PCR nie są wyrażane jako liczby. Zwykle konwencjonalny PCR jest w stanie wykryć tylko jeden parametr.
Co to jest PCR w czasie rzeczywistym?
Real-time PCR może wykryć amplifikację produktów, ponieważ produkty są syntetyzowane. Wraz z rozwojem technologii PCR stał się bardzo popularną techniką, zwłaszcza do wykrywania i identyfikacji bakterii w żywności. PCR w czasie rzeczywistym wykorzystuje system barwników fluorescencyjnych i termocykler wyposażony w funkcję wykrywania fluorescencyjnego.
Jaka jest różnica między konwencjonalnym PCR a Real-time PCR?
• Konwencjonalny PCR jest bardziej czasochłonny, ponieważ wykorzystuje elektroforezę żelową do analizy amplifikowanych produktów PCR. W przeciwieństwie do tego, PCR w czasie rzeczywistym jest mniej czasochłonny, ponieważ może wykryć amplifikację we wczesnych fazach reakcji.
• PCR w czasie rzeczywistym zbiera dane w fazie wykładniczego wzrostu PCR, podczas gdy tradycyjna reakcja PCR zbiera dane w punkcie końcowym reakcji.
• Wyniki punktu końcowego konwencjonalnej PCR mogą nie być bardzo precyzyjne, ale wyniki PCR w czasie rzeczywistym są bardzo precyzyjne.
• PCR w czasie rzeczywistym jest bardziej czuły niż konwencjonalny PCR.
• Konwencjonalny PCR ma bardzo słabą rozdzielczość, podczas gdy PCR w czasie rzeczywistym może wykryć bardzo małe zmiany ze względu na wysoką rozdzielczość.
• Detekcja punktu końcowego konwencjonalnego PCR ma krótki zakres dynamiczny, podczas gdy detekcja PCR w czasie rzeczywistym ma szeroki zakres dynamiczny.
• W przeciwieństwie do konwencjonalnego PCR, zautomatyzowane techniki wykrywania można znaleźć w PCR w czasie rzeczywistym.
• Konwencjonalny PCR jest wysoce wyrafinowany i pracochłonny bardziej niż PCR w czasie rzeczywistym.
• W przeciwieństwie do PCR w czasie rzeczywistym, konwencjonalny PCR nie rozróżnia martwych i żywych bakterii.
• Real-time PCR wykorzystuje system barwników fluorescencyjnych do wykrywania produktów, podczas gdy konwencjonalna PCR wykorzystuje bromek etydyny i światło UV do wizualizacji prążków w pożywce z żelem agarozowym.
