Kluczowa różnica między konwencjonalnymi testami PCR w czasie rzeczywistym i zagnieżdżonym polega na tym, że konwencjonalny PCR jest techniką opracowaną w celu amplifikacji określonych sekwencji DNA, a zagnieżdżony PCR jest modyfikacją konwencjonalnego PCR, który składa się z dwóch następujących po sobie reakcji amplifikacji, podczas gdy -time PCR jest wariantem konwencjonalnego PCR, który jest w stanie określić ilościowo amplifikowany produkt.
PCR to bardzo powszechna technika naukowa szeroko stosowana w badaniach i medycynie do wykrywania DNA. Testy PCR służą do wykrywania antygenów poprzez wykrywanie ich DNA lub RNA. Ogólnie rzecz biorąc, wirusowy RNA jest obecny w organizmie przed wykryciem przeciwciał lub pojawieniem się objawów choroby. Test PCR może stwierdzić, czy ktoś wcześnie ma wirusa. Obecnie PCR jest standardowym testem do wykrywania choroby COVID-19. Istnieją różne rodzaje technik PCR, takie jak real-time PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR i long-range PCR itp.
Czym są konwencjonalne testy PCR?
Konwencjonalny test PCR to technika amplifikacji DNA in vitro rutynowo wykonywana w laboratoriach biologii molekularnej. Metoda ta umożliwiła wytworzenie od tysięcy do milionów kopii określonego fragmentu DNA. Kary Mullis wprowadził tę technikę w 1980 roku. Ta technika wymaga fragmentu DNA znanego jako szablon, aby wykonać wiele jego kopii. Polimeraza Taq działa jako enzym polimerazy DNA i katalizuje syntezę nowych nici sekwencji matrycy.
Primery w mieszaninie PCR będą działać jako punkty startowe dla rozszerzeń fragmentów. Wszystkie składniki niezbędne do wykonania kopii DNA są zawarte w mieszaninie PCR. Reakcja PCR przebiega w maszynie do PCR i powinna być zasilana odpowiednią mieszaniną PCR i odpowiednim programem PCR. Jeśli mieszanina reakcyjna i program są prawidłowe, wytworzy wymaganą liczbę kopii określonego odcinka DNA z bardzo małej ilości DNA.
Rysunek 01: Konwencjonalny test PCR
Istnieją trzy główne etapy reakcji PCR: denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie nici. Te trzy etapy występują w trzech różnych temperaturach. Bufor PCR utrzymuje optymalne warunki dla działania polimerazy Taq. Te trzy etapy reakcji PCR są powtarzane w celu wytworzenia wymaganej ilości produktu PCR. W każdej reakcji PCR liczba kopii DNA podwaja się. Stąd w PCR można zaobserwować wykładniczą amplifikację. Produkt PCR można rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej, ponieważ wytwarza widoczną ilość DNA na żelu i można go oczyścić do dalszych badań, takich jak sekwencjonowanie.
PCR to cenne narzędzie w badaniach medycznych i biologicznych. Szczególnie w badaniach kryminalistycznych, PCR ma ogromną wartość, ponieważ może amplifikować DNA do badań z maleńkich próbek przestępców i tworzyć kryminalistyczne profile DNA. PCR jest szeroko stosowany w wielu obszarach biologii molekularnej, w tym w genotypowaniu, klonowaniu genów, wykrywaniu mutacji, sekwencjonowaniu DNA, mikromacierzach DNA i testowaniu ojcostwa.
Co to są testy zagnieżdżonego PCR?
Zagnieżdżona reakcja PCR to rodzaj reakcji PCR, który redukuje nieswoistą amplifikację DNA. W teście zagnieżdżonej PCR występują dwie następujące po sobie PCR lub dwie kolejne reakcje amplifikacji. Podczas pierwszej reakcji amplifikacji powstaje produkt PCR. Po pierwszej reakcji, druga reakcja amplifikacji jest przeprowadzana na produkcie PCR z pierwszej reakcji. Dlatego startery w drugiej mieszaninie reakcyjnej wiążą się z pierwszym produktem PCR i wzmacniają go.
Rysunek 02: Zagnieżdżony PCR
Pary starterów są różne w każdej reakcji. Niespecyficzne wiązanie starterów jest zmniejszone w nested PCR. Testy zagnieżdżonego PCR są przydatne do zwiększenia czułości i/lub swoistości. Jednak zagnieżdżony PCR wymaga wiedzy o interesującej sekwencji.
Co to są testy PCR w czasie rzeczywistym?
Real-time PCR lub ilościowy PCR (Q PCR) to zmodyfikowana wersja PCR, która mierzy ilościowo produkty PCR. Dlatego technika ta określa ilościowo amplifikację w czasie rzeczywistym przy użyciu maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Jest to również odpowiedni sposób określania ilości sekwencji docelowej lub genu obecnego w próbce.
Interesującą cechą PCR w czasie rzeczywistym jest to, że łączy ona zarówno amplifikację, jak i prawdziwą kwantyfikację w jednym kroku. Dlatego też potrzebę elektroforezy żelowej do wykrywania można wyeliminować techniką PCR w czasie rzeczywistym. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do znakowania produktów PCR podczas reakcji PCR ostatecznie doprowadzi do bezpośredniej oceny ilościowej. Kiedy gromadzą się produkty PCR, sygnały fluorescencyjne również się kumulują i będą mierzone przez maszynę czasu rzeczywistego. SYBR Green i Taqman to dwie metody wykrywania lub obserwowania procesu amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. Obie metody monitorują postęp procesu amplifikacji i raportują ilość produktu w czasie rzeczywistym.
Rysunek 03: PCR w czasie rzeczywistym
PCR w czasie rzeczywistym ma szeroki zakres zastosowań, takich jak kwantyfikacja ekspresji genów, analiza mikroRNA i niekodującego RNA, genotypowanie SNP, wykrywanie wariantów liczby kopii, wykrywanie rzadkich mutacji, wykrywanie organizmów modyfikowanych genetycznie i wykrywanie czynników zakaźnych.
Jakie są podobieństwa między konwencjonalnymi testami zagnieżdżonymi a testami PCR w czasie rzeczywistym?
- Testy PCR w czasie rzeczywistym i zagnieżdżone są modyfikacjami konwencjonalnego testu PCR.
- Wszystkie trzy techniki wzmacniają próbki DNA.
- Ich produkty mogą być używane w sekwencjonowaniu lub analizie.
- Te testy wymagają starterów.
Jaka jest różnica między konwencjonalnymi testami zagnieżdżonymi a testami PCR w czasie rzeczywistym?
Konwencjonalny PCR to technika opracowana w celu amplifikacji określonych sekwencji DNA. Tymczasem Nested PCR jest modyfikacją konwencjonalnego PCR, która składa się z dwóch kolejnych reakcji amplifikacji, a PCR w czasie rzeczywistym jest wariantem konwencjonalnego PCR, który jest w stanie określić ilościowo amplifikowany produkt. Jest to więc kluczowa różnica między konwencjonalnymi testami PCR w czasie rzeczywistym i zagnieżdżonym. W przeciwieństwie do konwencjonalnej i real-time PCR, nested PCR wykorzystuje dwa zestawy starterów. Ponadto w zagnieżdżonej reakcji PCR występują dwie następujące po sobie reakcje amplifikacji w celu zmniejszenia amplifikacji nieswoistej. poza tym testy konwencjonalnego i real-time PCR nie zawierają dwóch kolejnych reakcji amplifikacji.
Poniższa infografika przedstawia różnice między konwencjonalnymi testami PCR zagnieżdżonymi a testami PCR w czasie rzeczywistym w formie tabelarycznej do bezpośredniego porównania.
Podsumowanie - konwencjonalne, zagnieżdżone i real-time testy PCR
Konwencjonalny PCR to pierwsza technika opracowana do amplifikacji określonych fragmentów DNA. Nested PCR i real-time PCR to dwa warianty konwencjonalnego PCR. Istnieją dwie sekwencyjne reakcje amplifikacji i zastosowanie dwóch zestawów starterów w nested PCR. Real-time PCR jest opracowywany w celu ilościowego oznaczenia amplifikowanego produktu PCR. Tak więc podsumowuje to różnicę między konwencjonalnymi testami PCR w czasie rzeczywistym i zagnieżdżonym.
