Kluczowa różnica – Maxam Gilbert kontra sekwencjonowanie Sangera
Nukleotydy to podstawowe jednostki strukturalne i elementy budulcowe DNA. Cząsteczka DNA składa się z łańcucha polinukleotydowego. W DNA znajdują się cztery różne nukleotydy. Te nukleotydy składają się z czterech różnych zasad azotowych o nazwach A (adenina), G (guanina), C (cytozyna), T (tymina). Kolejność nukleotydów w cząsteczce DNA ma ogromne znaczenie, ponieważ koduje ważną informację genetyczną dla wzrostu i rozwoju organizmów. Sekwencjonowanie DNA odnosi się do procesu, który określa dokładną sekwencję nukleotydową DNA. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i sekwencjonowanie DNA Sangera to dwie metody sekwencjonowania DNA, które należą do sekwencjonowania pierwszej generacji. Procedura sekwencjonowania Maxama Gilberta określa sekwencję zasad poprzez chemiczne cięcie fragmentów DNA znakowanych na końcu 5' preferencyjnie w każdym z czterech nukleotydów i elektroforezie żelowej. Procedura sekwencjonowania Sangera określa sekwencję nukleotydową poprzez syntezę jednoniciowego DNA przy użyciu polimerazy DNA i dideoksynukleotydów oraz elektroforezy żelowej. To jest kluczowa różnica między sekwencjonowaniem Maxama Gilberta i Sangera.
Co to jest sekwencjonowanie Maxama Gilberta?
Sekwencjonowanie Maxama Gilberta, znane również jako metoda sekwencjonowania chemicznego, to technika opracowana w celu określenia kolejności nukleotydów w DNA. Metoda ta została wprowadzona przez W altera Gilberta i Alana Maxama w 1976 roku i stała się popularna, ponieważ można ją stosować bezpośrednio z oczyszczonym DNA. Metoda Maxama Gilberta należy do pierwszej generacji sekwencjonowania DNA i była to pierwsza metoda sekwencjonowania szeroko stosowana przez naukowców.
Podstawowa zasada tej metody polega na ograniczeniu fragmentów DNA znakowanych na końcach do określonych zasad przez chemikalia i warunki specyficzne dla zasad oraz oddzielenie znakowanych fragmentów przez elektroforezę, jak pokazano na rysunku 01. Fragmenty są rozdzielane zgodnie z do ich rozmiarów na żelu. Ponieważ fragmenty są znakowane, sekwencja cząsteczki DNA może być łatwo wywnioskowana.
Metoda Maxama Gilberta wykorzystuje specyficzne dla zasad chemikalia do rozbijania DNA w określonych podstawach. Do selektywnego atakowania odpowiednio puryn i pirymidyn używa się dwóch popularnych substancji chemicznych, siarczanu dimetylu i hydrazyny.
Metoda sekwencjonowania Maxama Gilberta jest wykonywana w kilku krokach w następujący sposób.
- Oczyszczanie sekwencji DNA za pomocą endonukleaz restrykcyjnych
- Oznakowanie końców fragmentów DNA poprzez dodanie radioaktywnych fosforanów
- Oczyszczanie znakowanych fragmentów z nieznakowanych fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej
- Rozdzielenie znakowanego końcowo DNA na cztery probówki i oddzielne traktowanie substancjami chemicznymi specyficznymi dla zasad
- Elektroforeza zawartości każdej probówki w oddzielnych liniach na żelu i rozdzielanie fragmentów według ich długości.
- Wykrywanie fragmentów przez autoradiograf.
Rysunek 01: Sekwencjonowanie Maxama Gilberta
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 roku w celu określenia sekwencji zasad danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie zakańczania łańcucha lub metoda sekwencjonowania Dideoxy. Metoda ta działa na zasadzie selektywnej inkorporacji dideoksynukleotydów kończących łańcuch (ddNTP), takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP, przez polimerazę DNA podczas syntezy jednoniciowego DNA w celu zakończenia tworzenia nici. Dideoksynukleotydy nie mają 3’ grup OH do tworzenia wiązań fosfodiestrowych z sąsiednim nukleotydem. W związku z tym tworzenie nici zatrzymuje się, gdy ddNTP zostanie włączony do nowo tworzącej się nici podczas sekwencjonowania Sangera.
W tej metodzie cztery oddzielne reakcje syntezy DNA (PCR) są przeprowadzane w czterech oddzielnych probówkach z jednym rodzajem ddNTP. Dostarczane są również inne wymagania dla probówek do PCR, w tym startery, dNTP, polimeraza Taq, specyficzne warunki itp. Cztery oddzielne reakcje są przeprowadzane w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach PCR powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane przez elektroforezę żelową. Następnie fragmenty wizualizuje się za pomocą znakowanego (radioaktywnego lub fluorescencyjnego) startera lub dNTP, jak pokazano na rysunku 02.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sangera
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem Maxama Gilberta i Sangera?
Maxam Gilbert kontra sekwencjonowanie Sangera |
|
| Sekwencjonowanie Maxama Gilberta to pierwsza technika opracowana do sekwencjonowania DNA. | Metoda sekwencjonowania Sangera została wprowadzona po metodzie sekwencjonowania Maxama Gilberta. |
| Zastosowanie | |
| Ta metoda jest rzadko używana. | Sekwencjonowanie Sangera jest rutynowo używane do sekwencjonowania. |
| Użycie niebezpiecznych chemikaliów | |
| Wykorzystuje niebezpieczne chemikalia. | Użycie niebezpiecznych chemikaliów jest ograniczone w porównaniu z metodą Maxama Gilberta. |
| Oznakowanie do wykrywania | |
| Ta metoda wykorzystuje radioaktywny P32 do znakowania końców fragmentów DNA. | Sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje radioaktywnie lub fluorescencyjnie znakowane ddNTP. |
Podsumowanie – Maxam Gilbert kontra sekwencjonowanie Sangera
Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i Sangera to dwa rodzaje technik sekwencjonowania DNA wchodzących w skład sekwencjonowania DNA pierwszej generacji. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta jest pierwszą metodą wprowadzoną do sekwencjonowania DNA w 1976 roku i jest wykonywane przez rozbijanie fragmentów DNA znakowanych na końcach przez chemikalia specyficzne dla zasad. Dlatego nazywa się to sekwencjonowaniem chemicznym. Metoda sekwencjonowania Sangera została wprowadzona w 1977 roku i opiera się na reakcjach zakończenia łańcucha sterowanych ddNTP. Metoda sekwencjonowania Sangera popularna od metody Maxama Gilberta ze względu na kilka wad metody Maxama Gilberta, takich jak nadmierne czasochłonność, stosowanie niebezpiecznych chemikaliów itp. To jest różnica między sekwencjonowaniem Maxama Gilberta i Sangera.
