Kluczowa różnica – sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie
Sekwencjonowanie DNA jest bardzo ważne dla analizy DNA, ponieważ wiedza o prawidłowym rozmieszczeniu nukleotydów w określonym regionie DNA ujawnia wiele ważnych informacji na jego temat. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie to dwie różne metody sekwencjonowania DNA szeroko stosowane w biologii molekularnej. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem polega na tym, że sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje dideoksynukleotydy do zakończenia syntezy DNA w celu odczytania sekwencji nukleotydowej, podczas gdy pirosekwencjonowanie wykrywa uwalnianie pirofosforanu poprzez włączenie nukleotydów i syntezę komplementarnej sekwencji w celu odczytania dokładnej kolejności sekwencji.
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania DNA pierwszej generacji opracowana przez Fredericka Sangera i jego uczelnie w 1977 roku. Jest również znana jako sekwencjonowanie łańcuchowe lub sekwencjonowanie dideoksy, ponieważ opiera się na terminacji łańcucha przez dideoksynukleotydy (ddNTP). Ta metoda była szeroko stosowana przez ponad 30 lat, aż do opracowania sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Technika sekwencjonowania Sangera umożliwiła odkrycie prawidłowej kolejności nukleotydów lub przyłączenie określonego fragmentu DNA. Opiera się na selektywnym wbudowaniu ddNTP i zakończeniu syntezy DNA podczas replikacji DNA in vitro. Unikalną cechą ddNTPs jest brak 3’ grup OH, aby kontynuować tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi nukleotydami. W związku z tym po przyłączeniu ddNTP wydłużanie łańcucha ustaje i kończy się od tego punktu. Istnieją cztery ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP – używane w sekwencjonowaniu Sangera. Te nukleotydy zatrzymują proces replikacji DNA, gdy są włączone do rosnącej nici DNA i powodują różne długości krótkiego DNA. Elektroforeza w żelu kapilarnym służy do uporządkowania tych krótkich nici DNA według ich rozmiarów na żelu, jak pokazano na rysunku 01.
Rysunek 1: Elektroforeza w żelu kapilarnym zsyntetyzowanego krótkiego DNA
W przypadku replikacji DNA in vitro należy zapewnić kilka wymagań. Są to enzym polimerazy DNA, matrycowy DNA, startery oligonukleotydowe i deoksynukleotydy (dNTP). W sekwencjonowaniu Sangera replikację DNA przeprowadza się w czterech oddzielnych probówkach wraz z czterema rodzajami ddNTP oddzielnie. Deoksynukleotydy nie są całkowicie zastąpione przez odpowiednie ddNTP. Mieszanina konkretnego dNTP (na przykład; dATP + ddATP) jest zawarta w probówce i replikowana. Cztery oddzielne produkty w probówkach umieszcza się na żelu w czterech oddzielnych studzienkach. Następnie, odczytując żel, można skonstruować sekwencję, jak pokazano na rysunku 02.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sangera
Sekwencjonowanie Sangera to ważna technika, która pomaga w wielu dziedzinach biologii molekularnej. Projekt genomu ludzkiego został pomyślnie zakończony przy pomocy metod opartych na sekwencjonowaniu Sangera. Sekwencjonowanie Sangera jest również przydatne w sekwencjonowaniu docelowego DNA, badaniach nad rakiem i chorobami genetycznymi, analizie ekspresji genów, identyfikacji człowieka, wykrywaniu patogenów, sekwencjonowaniu drobnoustrojów itp.
Istnieje kilka wad sekwencjonowania Sangera:
- Długość sekwencjonowanego DNA nie może być dłuższa niż 1000 par zasad
- Tylko jedna nić może być sekwencjonowana na raz.
- Proces jest czasochłonny i kosztowny.
Dlatego z czasem opracowano nowe zaawansowane techniki sekwencjonowania, aby przezwyciężyć te problemy. Jednak sekwencjonowanie Sangera jest nadal w użyciu ze względu na jego bardzo dokładne wyniki do około 850 fragmentów o długości par zasad.
Co to jest pirosekwencjonowanie?
Pirosekwencjonowanie to nowatorska technika sekwencjonowania DNA oparta na „sekwencjonowaniu przez syntezę”. Technika ta polega na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu. W procesie wykorzystywane są cztery różne enzymy: polimeraza DNA, sulfurylaza ATP, lucyferaza i apiraza oraz dwa substraty: fosfosiarczan adenozyny 5’ (APS) i lucyferyna.
Proces rozpoczyna się od związania startera z jednoniciową matrycą DNA, a polimeraza DNA rozpoczyna włączanie nukleotydów do niej komplementarnych. Kiedy nukleotydy łączą się ze sobą (polimeryzacja kwasu nukleinowego), uwalniają grupy pirofosforanowe (dwie połączone grupy fosforanowe) i energię. Każde dodanie nukleotydu uwalnia równomolową ilość pirofosforanu. Pirofosforan jest przekształcany w ATP przez siarkę ATP w obecności substratu APS. Wygenerowane ATP steruje konwersją lucyferyny do oksylucyferyny, w której pośredniczy lucyferaza, wytwarzając światło widzialne w ilościach, które są proporcjonalne do ilości ATP. Światło jest wykrywane przez detektor fotonów lub fotopowielacz i tworzy pirogram. Apyraza degraduje ATP i niewbudowane dNTP w mieszaninie reakcyjnej. Dodawanie dNTP odbywa się jednorazowo. Ponieważ dodanie nukleotydu jest znane na podstawie włączenia i wykrywania światła, można określić sekwencję matrycy. Pirogram służy do generowania sekwencji nukleotydowej próbki DNA, jak pokazano na rysunku 03.
Pirosekwencjonowanie jest bardzo ważne w analizie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu i sekwencjonowaniu krótkich odcinków DNA. Wysoka dokładność, elastyczność, łatwość automatyzacji i przetwarzania równoległego to zalety pirosekwencjonowania nad technikami sekwencjonowania Sangera.
Rysunek 03: Pirosekwencjonowanie
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem?
Sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie |
|
| Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania DNA oparta na selektywnym włączaniu ddNTP przez polimerazę DNA i terminacji łańcucha. | Pirosekwencjonowanie to metoda sekwencjonowania DNA oparta na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu. |
| Użycie ddNTP | |
| ddNTP są używane do zakończenia replikacji DNA | ddNTP nie są używane. |
| Zaangażowane enzymy | |
| Wykorzystywana jest polimeraza DNA. | Wykorzystywane są cztery enzymy: polimeraza DNA, sulfurylaza ATP, lucyferaza i apyraza. |
| Użyte podłoża | |
| APS i lucyferyna nie są używane. | Wykorzystywany jest fosfosiarczan adenozyny 5’ (APS) i lucyferyna. |
| Maksymalna temperatura | |
| To powolny proces. | To szybki proces. |
Podsumowanie – sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie
Sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie to dwie metody sekwencjonowania DNA stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sangera konstruuje kolejność nukleotydów w sekwencji przez zakończenie wydłużania łańcucha, podczas gdy konstrukt pirosekwencjonowania konstruuje dokładną kolejność nukleotydów w sekwencji przez włączenie nukleotydów i wykrywanie uwalniania pirofosforanów. Dlatego główna różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem polega na tym, że sekwencjonowanie Sangera działa na sekwencjonowanie przez zakończenie łańcucha, podczas gdy pirosekwencjonowanie działa na sekwencjonowanie przez syntezę.
