Kluczowa różnica między ogniskowaniem chromatograficznym a ogniskowaniem izoelektrycznym polega na tym, że ogniskowanie chromatograficzne jest rodzajem metody chromatografii kolumnowej, która wykorzystuje żywice jonowymienne, podczas gdy ogniskowanie izoelektryczne jest rodzajem techniki elektroforezy, która wykorzystuje unieruchomione żele gradientowe pH.
Chromatogniskowanie i ogniskowanie izoelektryczne to dwie techniki, które rozdzielają białka według ich punktów izoelektrycznych. Zarówno ogniskowanie chromatoogniskowe, jak i ogniskowanie izoelektryczne mają dużą zdolność rozdzielczą. Chromatofocusing jest metodą chromatografii kolumnowej o wysokiej rozdzielczości, podczas gdy ogniskowanie izoelektryczne jest metodą rozdziału elektroforetycznego. Co więcej, chromatoogniskowanie nie wykorzystuje pola elektrycznego, podczas gdy ogniskowanie izoelektryczne wymaga pola elektrycznego.
Co to jest chromatoogniskowanie?
Chromatogniskowanie to rodzaj wysokoelucyjnej chromatografii, która oddziela białka na podstawie różnic w ich punkcie izoelektrycznym. Wykorzystuje kolumnę z żywicą jonowymienną i wewnętrznie opracowany gradient pH. W przeciwieństwie do ogniskowania izoelektrycznego, chromatoogniskowanie nie obejmuje pola elektrycznego. Chromatoogniskowanie to potężna technika oczyszczania, która może rozdzielić bardzo podobne cząsteczki, nawet różniące się tylko o 0,02 jednostki pH. Dlatego też chromatoogniskowanie najlepiej nadaje się jako końcowy etap polerowania, gdy wymagana jest wysoka rozdzielczość do oddzielania bardzo podobnych komponentów.
W chromatoogniskowaniu próbka jest nakładana na kolumnę przez zmieszanie jej z buforem startowym. Białka o pH powyżej ich punktu izoelektrycznego są naładowane ujemnie i pozostają blisko szczytu kolumny, podczas gdy inne białka o pH poniżej ich punktu izoelektrycznego migrują w dół kolumny. Białko o najwyższym punkcie izoelektrycznym jest eluowane jako pierwsze, podczas gdy białko o najniższym punkcie izoelektrycznym jest eluowane jako ostatnie z kolumny. Na tę technikę wpływa kilka czynników, takich jak strącanie białka i liniowość gradientu pH.
Co to jest ogniskowanie izoelektryczne?
Ogniskowanie izoelektryczne to technika, która oddziela różne molekuły na podstawie ich punktu izoelektrycznego. Jest również znany jako elektrofokusowanie. Ta technika jest często stosowana do separacji białek w żelu. W ogniskowaniu izoelektrycznym próbka jest dodawana do żeli z unieruchomionym gradientem pH (IPG). Żel IPG to akrylamidowa matryca żelowa skopolimeryzowana z gradientem pH. Białka migrują w kierunku katody, aż znajdą region pH swoich punktów izoelektrycznych. Kiedy białko osiąga pH, które nie ma ładunku netto, migracja ustaje i daje stacjonarne pasmo. Podobnie, każde białko daje prążek w punkcie w gradiencie pH odpowiadającym jego punktowi izoelektrycznemu.
Rysunek 01: Ogniskowanie izoelektryczne
Ogniskowanie izoelektryczne jest pierwszym etapem dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. W tej technice białka są najpierw rozdzielane zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane według ich masy cząsteczkowej za pomocą SDS-PAGE.
Jakie są podobieństwa między chromatoogniskowaniem a ogniskowaniem izoelektrycznym?
- Chromaogniskowanie i ogniskowanie izoelektryczne to dwie wysoce rozdzielcze metody.
- Oba są oparte na punkcie izoelektrycznym białek.
- Te techniki wykorzystują gradient pH.
- Obie procedury mają charakter informacyjny dla scharakteryzowania wariantów ludzkiej hemoglobiny.
- Mogą rozwiązać cząsteczki, w których wartości pI różnią się nawet o 0,02 jednostki pH.
Jaka jest różnica między ogniskowaniem chromatograficznym a ogniskowaniem izoelektrycznym?
Chromatogniskowanie to technika chromatografii kolumnowej o wysokiej rozdzielczości, która oddziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym. W przeciwieństwie do tego, ogniskowanie izoelektryczne jest techniką elektroforetyczną, która rozdziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym poprzez przyłożenie pola elektrycznego wzdłuż gradientu pH utworzonego w kapilarze. To jest więc kluczowa różnica między ogniskowaniem chromatoogniskowym a ogniskowaniem izoelektrycznym.
Kolejną różnicą między ogniskowaniem chromatograficznym a ogniskowaniem izoelektrycznym jest to, że ogniskowanie chromatograficzne nie obejmuje pola elektrycznego, podczas gdy ogniskowanie izoelektryczne wymaga pola elektrycznego.
Podsumowanie – Chromatofokusowanie a ogniskowanie izoelektryczne
Chromatogniskowanie i ogniskowanie izoelektryczne to dwie podobne techniki, które charakteryzują się wysoką zdolnością rozdzielczą molekuł, zwłaszcza bardzo podobnych molekuł. Chromatofocusing jest techniką chromatografii kolumnowej o wysokiej rozdzielczości, podczas gdy ogniskowanie izoelektryczne jest metodą elektroforezy. Chromatoogniskowanie nie obejmuje pola elektrycznego, w przeciwieństwie do ogniskowania izoelektrycznego. Tak więc podsumowuje to różnicę między ogniskowaniem chromatoogniskowym a ogniskowaniem izoelektrycznym.
