Kluczowa różnica – NGS kontra sekwencjonowanie Sangera
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i sekwencjonowanie Sangera to dwa rodzaje technik sekwencjonowania nukleotydów, które rozwinęły się z biegiem czasu. Metoda Sanger Sequencing była szeroko stosowana przez wiele lat, a NGS zastąpił ją niedawno ze względu na jej zalety. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem NGS i Sanger polega na tym, że NGS działa na zasadzie sekwencjonowania milionów sekwencji jednocześnie w szybki sposób przez system sekwencjonowania, podczas gdy sekwencjonowanie Sanger działa na zasadzie terminacji łańcucha z powodu selektywnego włączania dideoksynukleotydów przez enzym polimerazy DNA podczas replikacji DNA i wynikającego z tego rozdziału fragmentów metodą elektroforezy kapilarnej.
Co to jest sekwencjonowanie nukleotydów?
Informacje genetyczne są przechowywane w sekwencjach nukleotydowych DNA lub RNA organizmu. Proces określania prawidłowej kolejności nukleotydów (przy użyciu czterech zasad) w danym fragmencie (w genie, skupisku genów, chromosomie i całym genomie) jest znany jako sekwencjonowanie nukleotydów. W badaniach genomicznych, kryminalistycznych, wirusologicznych, systematycznych biologii, diagnostyce medycznej, biotechnologii oraz w wielu innych dziedzinach bardzo ważne jest analizowanie struktury i funkcji genów. Istnieją różne rodzaje metod sekwencjonowania opracowane przez naukowców. Wśród nich sekwencjonowanie Sangera opracowane przez Fredericka Sangera w 1977 roku było szeroko stosowane i spopularyzowane przez długi czas, dopóki nie zastąpiło go sekwencjonowanie nowej generacji.
Co to jest NGS?
Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) to termin używany w odniesieniu do nowoczesnych procesów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania, które zrewolucjonizowały badania genomiczne i biologię molekularną. Techniki te to sekwencjonowanie Illumina, sekwencjonowanie Roche 454, sekwencjonowanie jonowoprotonowe i sekwencjonowanie SOLiD (sekwencjonowanie przez Oligo Ligation Detection). Systemy NGS są szybsze i tańsze. W systemach NGS stosowane są cztery główne metody sekwencjonowania DNA, a mianowicie; pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie przez syntezę, sekwencjonowanie przez ligację i sekwencjonowanie półprzewodników jonowych. Równolegle można sekwencjonować dużą liczbę nici DNA lub RNA (miliony). Pozwala na sekwencjonowanie całego genomu organizmów w krótkim czasie, w przeciwieństwie do sekwencjonowania Sangera, które zajmuje więcej czasu.
NGS ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną metodą sekwencjonowania Sangera. Jest to szybki, dokładniejszy i bardziej opłacalny proces, który można przeprowadzić przy małej wielkości próbki. NGS może być stosowany w badaniach metagenomicznych, w wykrywaniu zmian w obrębie pojedynczego genomu spowodowanych insercjami i delecjami itp. oraz w analizie ekspresji genów.
Rysunek_1: Rozwój sekwencjonowania NGS
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 roku w celu określenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie zakańczania łańcucha lub sekwencjonowanie dideoksy. Zasadą działania tej metody jest zakończenie syntezy nici poprzez selektywne włączenie przez polimerazę DNA podczas replikacji DNA dideoksynukleotydów (ddNTP) kończących łańcuch, takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP. Normalne nukleotydy mają 3' grupy OH do tworzenia wiązania fosfodiestrowego między sąsiednimi nukleotydami, aby kontynuować tworzenie nici. Jednak ddNTPs nie mają tej grupy 3’ OH i nie są w stanie tworzyć wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami. W ten sposób wydłużenie łańcucha ustało.
W tej metodzie jednoniciowy DNA, który ma być sekwencjonowany, służy jako nić matrycowa do syntezy DNA in vitro. Inne wymagania to starter oligonukleotydowy, prekursory deoksynukleotydowe i enzym polimerazy DNA. Gdy znane są flankujące końce fragmentu docelowego, startery można łatwo zaprojektować do replikacji DNA. W czterech oddzielnych probówkach przeprowadza się cztery oddzielne reakcje syntezy DNA. Każda rurka ma osobne ddNTP wraz z innymi wymaganiami. Z konkretnego nukleotydu dodawana jest mieszanina dNTP i ddNTP. Podobnie cztery oddzielne reakcje przeprowadza się w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach następuje detekcja fragmentów DNA i konwersja wzoru fragmentów na informacje o sekwencji. Powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane przez elektroforezę żelową. Jeśli stosuje się radioaktywne nukleotydy, wzór prążków w żelu poliakrylamidowym można zwizualizować za pomocą autoradiografii. Gdy ta metoda wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane dideoksynukleotydy, można ją osłabić w odczycie w żelu i przepuścić przez wiązkę lasera w celu wykrycia przez detektor fluorescencyjny. Aby uniknąć błędów, które mogą wystąpić, gdy sekwencja jest odczytywana przez oko i wprowadzana ręcznie do komputera, ta metoda rozwinęła się w użycie automatycznego sekwencera połączonego z komputerem.
To jest metoda używana do sekwencjonowania DNA z projektu ludzkiego genomu. Ta metoda jest nadal używana z zaawansowanymi modyfikacjami, ponieważ zapewnia dokładne informacje o sekwencji, mimo że jest procesem kosztownym i powolnym.
Rysunek_2: Sekwencjonowanie Sangera
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem NGS a Sangerem?
NGS kontra sekwencjonowanie Sangera |
|
| Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) odnosi się do nowoczesnych procesów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania | Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera w celu określenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA. |
| Opłacalność | |
| NGS jest tańszym procesem, ponieważ zmniejsza czas, siłę roboczą i środki chemiczne. | Jest to kosztowny proces, ponieważ wymaga czasu, siły roboczej i większej ilości środków chemicznych. |
| Prędkość | |
| Jest to szybsze, ponieważ zarówno detekcja chemiczna, jak i wykrywanie sygnału wielu nici odbywa się równolegle. | Jest to czasochłonne, ponieważ detekcja chemiczna i detekcja sygnału odbywają się jako dwa oddzielne procesy i tylko na nici można odczytać na raz. |
| Niezawodność | |
| NGS jest niezawodny. | Sekwencjonowanie Sangera jest mniej niezawodne |
| Rozmiar próbki | |
| NGS wymaga mniejszej ilości DNA. | Ta metoda wymaga dużej ilości szablonu DNA. |
| Bazy DNA na zsekwencjonowany fragment | |
| Liczba zasad DNA na zsekwencjonowany fragment jest niższa niż w metodzie Sangera | Sekwencje generujące są dłuższe niż sekwencje NGS. |
Podsumowanie – NGS kontra sekwencjonowanie Sangera
NGS i Sanger Sequencing to techniki sekwencjonowania nukleotydów szeroko stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sangera to wczesna metoda sekwencjonowania, która została zastąpiona przez NGS. Główna różnica między sekwencjonowaniem NGS i Sanger polega na tym, że NGS jest procesem szybkim, dokładniejszym i bardziej opłacalnym niż sekwencjonowanie Sangera. Obie techniki spowodowały poważne epidemie w genetyce i biotechnologii.
