Kluczowa różnica – Nick Translation vs Primer Extension
Translacja nicka i wydłużanie startera to dwie ważne techniki stosowane w biologii molekularnej. Kluczowa różnica między translacją naciętą a wydłużeniem startera polega na tym, że w procesie nacinania translacji powstają znakowane sondy dla innych technik hybrydyzacji, podczas gdy metoda wydłużania startera identyfikuje konkretną sekwencję RNA z mieszaniny i ujawnia informacje o ekspresji mRNA. Obie techniki mają ogromne znaczenie i są rutynowo wykonywane w laboratoriach badań molekularnych.
Co to jest tłumaczenie Nicka?
Translacja Nicka jest ważną techniką wykorzystywaną do przygotowania znakowanych sond do różnych technik biologii molekularnej, takich jak blotting, hybrydyzacja in situ, hybrydyzacja fluorescencyjna in situ itp. Jest to metoda znakowania DNA in vitro. Sondy DNA służą do identyfikacji określonych sekwencji DNA lub RNA. Za pomocą znakowanej sondy można oznaczać lub wizualizować specyficzne fragmenty złożonej mieszaniny kwasów nukleinowych. Dlatego znakowane sondy są przygotowywane przy użyciu różnych technik, które mają być stosowane w różnych technikach. Translacja Nicka jest jedną z takich metod, która wytwarza znakowane sondy za pomocą enzymów DNAzy 1 i polimerazy DNA 1.
Proces translacji nicków rozpoczyna się od aktywności enzymu DNazy 1. DNaza 1 wprowadza nacięcia w fosforanowym szkielecie dwuniciowego DNA poprzez przecinanie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami. Po utworzeniu nacięcia zostanie uwolniona wolna grupa 3’ OH nukleotydu i będzie na nią działał enzym polimerazy DNA 1. Aktywność 5’ do 3’ egzonukleazy polimerazy DNA 1 usuwa nukleotydy z nacięcia w kierunku 3’ nici DNA. Jednocześnie działa aktywność polimerazy enzymu polimerazy DNA 1 i dodaje nukleotydy w celu zastąpienia usuniętych nukleotydów. Jeśli nukleotydy były znakowane, zastąpienie nastąpi przez znakowane nukleotydy i oznaczy DNA do identyfikacji. Ten nowo zsyntetyzowany znakowany DNA może być używany jako sondy w różnych reakcjach hybrydyzacji w biologii molekularnej.
Rysunek 01: Proces tłumaczenia Nicka
Co to jest rozszerzenie Primer?
Rozszerzenie startera to technika, która służy do znalezienia określonej sekwencji RNA z mieszaniny RNA i zlokalizowania końca 5' transkryptu mRNA. Służy również do badania struktury RNA i ekspresji. Metoda wydłużania starterów jest przeprowadzana za pomocą znakowanych starterów lub znakowanych nukleotydów. Jeśli stosuje się znakowane startery, wyklucza to konieczność znakowania nukleotydów, które są używane do syntezy cDNA. W tej technice jest kilka kroków. Rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbki. Następnie do mieszaniny dodaje się znakowany starter oligonukleotydowy wraz z niezbędnymi składnikami do syntezy cDNA o określonej sekwencji RNA. Wyżarzanie podkładów z sekwencją komplementarną z mieszaniny. Używając sekwencji przyłączonej do startera jako matrycy, enzym odwrotna transkryptaza syntetyzuje komplementarny DNA (cDNA) sekwencji RNA. Wyżarzanie starterów i odwrotna transkrypcja występują tylko wtedy, gdy w próbce występuje specyficzna sekwencja RNA. Wreszcie, gdy przeprowadza się elektroforezę w żelu denaturującym, można określić wielkość sekwencji RNA. Łatwo jest również znaleźć +1 zasady sekwencji mRNA (miejsce inicjacji transkrypcji) metodą wydłużania startera. Ilość mRNA obecnego w próbce można określić ilościowo tą metodą, jeśli użyty zostanie nadmiar startera.
Rysunek 02: Rozszerzenie startera
Jaka jest różnica między Nick Translation a Primer Extension?
Nick Translation a rozszerzenie Primer |
|
| Translacja Nicka to proces, który tworzy znakowane sondy DNA dla różnych reakcji hybrydyzacji. | Rozszerzenie startera to technika wykorzystywana do znajdowania określonego RNA lub badania ekspresji genów. |
| Wykorzystane enzymy | |
| Wykorzystywane są enzymy DNAzy 1 i polimerazy DNA. | Wykorzystywany jest enzym odwrotnej transkryptazy. |
| Ważność | |
| Translacja Nicka ułatwia oznaczenie określonej sekwencji DNA. | Rozszerzenie startera umożliwia wykrycie określonej wielkości sekwencji mRNA i ilości obecnej w próbce. |
Podsumowanie – Nick Translation vs Primer Extension
Translacja Nicka to metoda stosowana do syntezy znakowanych sond w oparciu o aktywność enzymów polimerazy DNA 1 DNazy 1 i E coli. Jest to metoda in vitro stosowana w laboratoriach przed różnymi technikami hybrydyzacji. Podczas translacji nacięcia, aktywność 5'-3' egzonukleazy polimerazy DNA 1 usuwa nukleotydy przed nacięciem, a aktywność polimerazy polimerazy DNA 1 zastępuje usunięte nukleotydy znakowanymi nukleotydami za nacięciem. Wydłużenie startera to metoda stosowana do wykrywania specyficznego transkryptu RNA z mieszaniny i ilościowego określania wielkości i ilości interesującego RNA. To jest różnica między tłumaczeniem nicków a wydłużeniem startera.
