Kluczowa różnica między translacją nacięć a wypełnianiem końców polega na tym, że translacja nacięć jest procesem, który tworzy znakowane sondy DNA dla różnych reakcji hybrydyzacji, podczas gdy wypełnianie końców jest techniką, która tworzy stępione fragmenty poprzez dodanie nukleotydów do jednoniciowych nawisów.
Translacja nicków i wypełnianie końcówek to dwie techniki stosowane w biologii molekularnej. Translację Nicka stosuje się do znakowania sond do hybrydyzacji w celu wykrycia określonych sekwencji nukleotydowych. Nadzienie końcowe służy do tworzenia stępionych fragmentów, które miały lepkie końce z jednoniciowymi nawisami. Obie techniki mają ogromne znaczenie i są rutynowo wykonywane w laboratoriach badań molekularnych.
Co to jest tłumaczenie Nicka?
Translacja nickowa jest ważną techniką wykorzystywaną do przygotowania znakowanych sond do różnych technik biologii molekularnej, takich jak blotting, hybrydyzacja in situ, hybrydyzacja fluorescencyjna in situ itp. Jest to metoda znakowania DNA in vitro. Sondy DNA służą do identyfikacji określonych sekwencji DNA lub RNA. Za pomocą znakowanej sondy można oznaczać lub wizualizować specyficzne fragmenty złożonej mieszaniny kwasów nukleinowych. Dlatego znakowane sondy są przygotowywane przy użyciu różnych technik. Translacja Nicka jest jedną z takich metod, która wytwarza znakowane sondy za pomocą enzymów DNAzy 1 i polimerazy DNA 1.
Rysunek 01: Tłumaczenie Nicka
Proces translacji Nicka rozpoczyna się od aktywności enzymu DNazy 1. DNaza 1 wprowadza nacięcia do szkieletu fosforanowego dwuniciowego DNA poprzez przecinanie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami. Po utworzeniu nacięcia zostanie wytworzona wolna grupa 3′ OH nukleotydu, na którą będzie działał enzym polimerazy DNA 1. Aktywność 5′ do 3′ egzonukleazy polimerazy DNA 1 usuwa nukleotydy z nacięcia w kierunku 3′ nici DNA.
Równocześnie, aktywność polimerazy DNA polimerazy 1 działa i dodaje nukleotydy w celu zastąpienia usuniętych nukleotydów. Jeśli nukleotydy są znakowane, zastąpienie nastąpi przez znakowane nukleotydy i oznaczy DNA do identyfikacji. Wreszcie, ten nowo zsyntetyzowany znakowany DNA może być używany jako sondy w różnych reakcjach hybrydyzacji.
Co to jest wypełnianie końcowe?
Wypełnianie końcowe to technika stosowana w biologii molekularnej do tworzenia stępionych fragmentów. Trawienie restrykcyjne wytwarza fragmenty z nawisami. Te fragmenty mogą nie nadawać się do ligacji do wektorów plazmidowych. Wektory są często tępe, aby umożliwić łączenie niekompatybilnych końców. Dlatego fragmenty z nawisami można stępić, dodając nukleotydy do nici komplementarnej, stosując nawis jako matrycę do polimeryzacji. Ten proces jest znany jako napełnianie końca.
Polimerazy DNA, takie jak fragment Klenowa polimerazy DNA I i polimeraza DNA T4 katalizują końcowe wypełnienie. Dodają nukleotydy do wypełnienia (5′ → 3′) i przeżuwają (3′ → 5′). Gdy lepkie końce są wypełnione, stają się tępe i są gotowe do ligacji w wektor.
Ponadto, do znakowania cząsteczek DNA można użyć nadzienia końcowego. Jednak może być używany tylko do znakowania cząsteczek DNA lepkimi końcami. W porównaniu do translacji nicków, wypełnianie końcówek jest łagodniejszą metodą, która rzadko powoduje pęknięcia DNA.
Jakie są podobieństwa między tłumaczeniem Nicka a wypełnianiem końca?
- Zarówno translacja nicków, jak i wypełnianie końcówek to techniki biologii molekularnej.
- Mogą być używane do oznaczania sond.
- Oba są in vitro
Jaka jest różnica między tłumaczeniem Nicka a wypełnianiem końca?
Translacja Nicka to technika, która tworzy znakowane sondy do hybrydyzacji. W przeciwieństwie do tego, wypełnianie końców jest techniką, która tworzy tępe fragmenty do ligacji do wektorów. Jest to więc kluczowa różnica między tłumaczeniem nicków a wypełnianiem końcówek. Co więcej, translacja Nicka wymaga użycia aktywności egzonukleazy od 5’ do 3’, podczas gdy końcowe wypełnienie nie wymaga aktywności egzonukleazy od 5’ do 3’.
Poniższa infografika bardziej szczegółowo przedstawia różnice między tłumaczeniem nicków a wypełnianiem końcówek.
Podsumowanie – Tłumaczenie Nicka a wypełnianie końcowe
Translacja Nicka to metoda, która włącza znakowane radioaktywnie nukleotydy do DNA. Syntetyzuje znakowane sondy w oparciu o aktywność enzymów DNAzy 1 DNazy 1 i polimerazy 1 DNA E. coli. Z drugiej strony wypełnianie końcowe to technika, w której powstają tępe fragmenty. Gdy fragmenty mają lepkie końce (jednoniciowe nawisy), konieczne jest ich stępienie w celu ligacji w wektory. Wypełnianie końców dodaje kompatybilne nukleotydy i tworzy fragmenty tępych końców w celu nadania im kompatybilności do ligacji. W ten sposób podsumowuje różnicę między tłumaczeniem nicków a wypełnianiem końców.
