Kluczowa różnica – sonda a podkład
Sonda molekularna to mały fragment DNA lub RNA, który rozpoznaje sekwencje komplementarne w DNA lub RNA i umożliwia identyfikację sekwencji docelowej. Primer to mały odcinek DNA lub RNA, który służy jako punkt wyjścia do syntezy DNA. Startery i sondy hybrydyzują z komplementarnymi nukleotydami matrycowego DNA lub docelowego DNA. Jednak kluczowa różnica między sondą a starterem polega na tym, że startery są niezbędne do replikacji DNA, podczas gdy sondy są niezbędne do wykrywania określonych sekwencji w DNA próbki.
Co to jest sonda?
Sonda to mały fragment DNA lub RNA używany do wykrywania docelowego DNA lub RNA w próbce poprzez hybrydyzację molekularną. Znane są również jako markery molekularne. Długość sondy może się zmieniać (100 do 1000 zasad), a nukleotydy sondy są komplementarne do części sekwencji docelowej. Aby ułatwić wykrywanie, sondy są znakowane izotopami promieniotwórczymi lub barwnikami fluorescencyjnymi lub przeciwciałami. Sondy wiążą się z komplementarnymi zasadami sekwencji docelowej i ujawniają obecność docelowego DNA lub RNA w próbce. Istnieją dwie główne metody znakowania sond: znakowanie końców i translacja nicków. Sondy są podzielone na różne typy, w tym sondy DNA, sondy RNA, sondy cDna i sondy do syntetycznych oligonukleotydów, i są przygotowywane przy użyciu różnych technik.
Sondy są ważnymi narzędziami w wielu obszarach mikrobiologicznych i molekularnych, takich jak wirusologia, patologia sądowa, badanie ojcostwa, odciski palców DNA, wykrywanie chorób genetycznych, RFLP, cytogenetyka molekularna, hybrydyzacja in situ itp.
Rysunek 01: Sonda znakowana fluorescencyjnie używana w FISH do wykrywania patogenów
Co to jest podkład?
Primer to krótki fragment DNA lub RNA, który służy jako inicjator syntezy DNA. Enzym polimerazy DNA dodaje nukleotydy do grupy 3' OH sekwencji startera i syntetyzuje nową nić komplementarną do matrycy DNA. Startery to bardzo krótkie fragmenty o długości od 18 do 20 nukleotydów. Są one syntetyzowane chemicznie w laboratorium do amplifikacji DNA in vitro (PCR). Startery mogą mieć dowolną sekwencję nukleotydów, ponieważ zostały zaprojektowane przez użytkownika. Są syntetyzowane tak, aby pasowały do komplementarnych zasad matrycy DNA. Dlatego może mieć dowolną sekwencję nukleotydów. Startery mają ogromne znaczenie dla replikacji DNA, ponieważ polimeraza DNA nie może syntetyzować nowego DNA bez wcześniej istniejącego fragmentu DNA. Projektując startery do PCR, należy wziąć pod uwagę następujące rzeczy:
- Primery powinny zawierać nukleotydy komplementarne do flankującego końca DNA, który chce się amplifikować.
- Podkłady powinny mieć temperaturę topnienia od 55 do 65 0C
- Zawartość G i C powinna wynosić od 50 do 60%.
Dwa startery są używane w reakcji PCR w przód i w tył do replikacji obu nici próbki DNA. Startery są powszechnie używane do przeprowadzania PCR i sekwencjonowania DNA.
Rysunek 02: Wyżarzanie podkładu w PCR
Jaka jest różnica między sondą a podkładem?
Sonda a podkład |
|
| Sonda to mały fragment DNA/RNA używany do wykrywania obecności sekwencji docelowej w próbce poprzez hybrydyzację molekularną. | Primer to mały odcinek DNA lub RNA, który służy jako punkt wyjścia do replikacji DNA. |
| Funkcja | |
| Wykrywa obecność określonej sekwencji w próbce DNA lub RNA. | Działa to jako punkt wyjścia do syntezy DNA. |
| Długość | |
| Długość może mieścić się w zakresie 100 – 1000 zasad | Długość to na ogół około 18 – 20 podstaw |
| Powiązanie z sekwencją komplementarną | |
| Sonda hybrydyzuje z komplementarnymi zasadami sekwencji docelowej | Wygrzewanie podkładowe z komplementarnymi zasadami nici DNA. |
| Etykietowanie | |
| Sondy są oznakowane w celu ułatwienia wykrywania | Podkłady generalnie nie są oznaczone |
| Użyj w PCR | |
| Sondy nie są używane w PCR | Podkłady są używane w PCR |
Podsumowanie – sonda kontra podkład
Sonda to mały fragment sekwencji DNA lub RNA, który można hybrydyzować z komplementarnymi nukleotydami w celu wykrycia sekwencji docelowej w próbce. Sondy są znakowane radioaktywnie, immunologicznie lub fluorescencyjnie, aby zobaczyć obecność sekwencji docelowej. Primer to bardzo mały fragment DNA lub RNA, który działa jako punkt wyjścia do amplifikacji DNA in vitro. Polimeraza DNA identyfikuje starter 3’ grupy OH i inicjuje budowę nowej nici komplementarnej do matrycy. Sondy i startery działają podobnie, hybrydyzując z komplementarnymi nukleotydami. Zatem kluczową różnicą między sondą a starterem jest ich pierwsza funkcja.
