Kluczowa różnica – podkład do przodu i do tyłu
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to metoda amplifikacji DNA wykorzystywana w zastosowaniach biologii molekularnej. Jest to powszechnie stosowana technika, która tworzy miliony do miliardów kopii szczególnie interesującej sekwencji DNA. Jest to metoda in vitro wykonywana w laboratoriach. Technika PCR jest całkowicie zależna od komercyjnie produkowanej polimerazy DNA zwanej polimerazą Taq. A także wymaga kilku innych komponentów i odpowiedniego utrzymania temperatury. Jednym z ważnych składników są podkłady. Startery to krótkie sekwencje DNA zaprojektowane specjalnie dla docelowej sekwencji DNA. Zwykle mają długość około 20 nukleotydów. Polimeraza Taq katalizuje dodawanie nukleotydów do istniejącej sekwencji nukleotydowej. Stąd startery służą jako punkty wyjścia do syntezy nowych nici. Polimeraza Taq działa tylko w kierunku 5’ do 3’, stąd synteza DNA zachodzi w tym samym kierunku 5’ do 3’. Ponieważ DNA jest dwuniciowy, w reakcji PCR potrzebne są dwa rodzaje starterów. Są one znane jako starter przedni i starter wsteczny. Startery przedni i wsteczny są określane w oparciu o kierunek wydłużania się startera w DNA, gdy zachodzi synteza DNA. Primer przedni przyłącza się do antysensownej nici DNA i inicjuje syntezę nici +ve genu w kierunku 5’ do 3’. Odwrotny starter przyłącza się do nici sensownej i inicjuje syntezę komplementarnej nici nici kodującej; czyli –ve nić genu w kierunku 5’do 3’. Jest to kluczowa różnica między starterami przednimi i wstecznymi.
Co to jest podkład do przodu?
Orientacja do przodu to synteza nici kodującej lub nici sensownej genu. Polimeraza Taq katalizuje syntezę nowej nici w kierunku od 5’ do 3’. Synteza nici kodującej zachodzi, gdy starter łączy się z nicią niekodującą lub antysensowną i wydłuża się w kierunku 5’ do 3’.
Rysunek 01: Rozruszniki do przodu i do tyłu
Starter, który hybrydyzuje z nicią antysensowną lub nicią niekodującą lub nicią matrycową jest znany jako przedni starter, ponieważ przedni starter działa jako punkt wyjścia do syntezy kodującej lub dodatniej nici genu. Przedni starter ma krótką sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do flankującego końca 3' nici antysensownej. Hybryduje z nicią antysensowną i ułatwia polimerazie Taq dodawanie nukleotydów, które są komplementarne do nici matrycy.
Co to jest odwrócony podkład?
Starter odwrotny to krótka sekwencja DNA, która hybrydyzuje z końcem 3’ nici sensownej lub nici kodującej. Starter odwrotny służy jako punkt wyjścia do syntezy komplementarnej nici sekwencji kodującej lub sekwencji niekodującej. Starter odwrotny jest zaprojektowany jako komplementarny do końca 3' nici kodującej. W związku z tym łączy się z flankującym 3' końcem nici kodującej i umożliwia polimerazie Taq syntezę nici antysensownej lub nici matrycowej. Ponieważ jego orientacja jest odwrotna, starter ten jest oznaczony jako starter wsteczny.
Zarówno startery wsteczne, jak i lewe są ważne dla produkcji od milionów do miliardów kopii określonych regionów DNA, które są celem lub zainteresowaniem.
Jakie są podobieństwa między podkładem do przodu i do tyłu?
- Zarówno startery do przodu, jak i do tyłu są wykonane z oligonukleotydów.
- Zarówno przedni, jak i odwrotny starter posiadają krótką sekwencję nukleotydową komplementarną do flankujących końców podwójnych nici DNA.
- Zarówno startery do przodu, jak i do tyłu zwykle składają się z 20 nukleotydów.
- W reakcjach łańcuchowych polimerazy używane są zarówno startery przedni, jak i odwrotny.
- Zarówno startery do przodu, jak i do tyłu są syntetyzowane komercyjnie.
- Zarówno startery do przodu, jak i do tyłu są stabilne temperaturowo i zwykle mają podobną Tm.
- Zarówno startery przedni, jak i odwrotny są wygrzewane z docelowymi sekwencjami DNA.
- Zarówno startery do przodu, jak i do tyłu są zaprojektowane zgodnie z reakcjami PCR.
- Zarówno startery przedni, jak i odwrotny służą jako punkty wyjścia do amplifikacji DNA.
- Zarówno startery wsteczne, jak i lewe są ważne dla produkcji milionów kopii określonych regionów docelowych lub zainteresowanych sekwencji DNA.
Jaka jest różnica między podkładem do przodu i do tyłu?
Podkład do przodu kontra podkład odwrotny |
|
| Starter przedni to krótka sekwencja DNA, która hybrydyzuje z 3’-końcem niekodującej lub matrycowej nici genu i służy jako punkt wyjścia do syntezy sekwencji kodującej. | Starter odwrotny to krótka sekwencja DNA, która hybrydyzuje z końcem 3’ kodującej lub nici niematrycowej i służy jako punkt wyjścia do syntezy sekwencji niekodującej. |
| Pasmo do wyżarzania | |
| Wyżarzanie starterów do przodu za pomocą nici szablonu. | Odwrotne wyżarzanie startera z nicią niematrycową. |
| Wynik nowej sekwencji | |
| Podkład do przodu ułatwia syntezę sekwencji kodującej. | Odwrotny starter ułatwia syntezę niekodującej sekwencji. |
Podsumowanie – podkład do przodu i do tyłu
Istnieją dwa rodzaje starterów zaangażowanych w technikę PCR. Są starterami do przodu i do tyłu. W oparciu o wydłużenie startera w syntezie nowej nici DNA, startery te są oznakowane lub nazwane. Polimeraza Taq syntetyzuje nowy DNA w orientacji od 5’ do 3’. Stąd startery są zaprojektowane jako komplementarne do końców 3' podwójnych nici. Starter przedni, który wydłuża się w kierunku 5’ do 3’ hybrydyzuje z końcem 3’ antysensownej lub matrycy lub sekwencji niekodującej. Służy jako punkt wyjścia do syntezy sekwencji kodującej. Starter odwrotny, który wydłuża się w kierunku 5’ do 3’ hybrydyzuje z 3’ końcem kodującym lub niematrycowym lub nicią sensowną. Służy jako punkt wyjścia do syntezy sekwencji niekodującej. Jest to różnica między starterem przednim a starterem wstecznym.
