Kluczowa różnica między Golden Gate a Gibson Assembly polega na tym, że Golden Gate opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana, podczas gdy Gibson Assembly nie opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji być sklonowanym.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci naukowcy molekularni opracowali różne znormalizowane procedury, które umożliwiają łatwiejsze składanie wielu fragmentów DNA w jeden element. Dlatego metody klonowania, takie jak Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly i TOPO Cloning, są szeroko stosowane przez badaczy w eksperymentach naukowych. Dlatego Golden Gate i Gibson Assembly to dwie metody klonowania molekularnego, które umożliwiają połączenie wielu fragmentów DNA w jeden element.
Co to jest Zgromadzenie Golden Gate?
Golden Gate to molekularna metoda klonowania, która ułatwia łączenie wielu fragmentów DNA w jeden element. Metoda ta opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w obrębie określonej sekwencji, która ma być sklonowana. Powstała w 1996 roku. Technika ta wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS i ligazę DNA T4. Enzymy te tną DNA poza miejscami rozpoznania. Mogą tworzyć niepalindromiczne nawisy. W związku z tym wiele fragmentów DNA można złożyć przy użyciu kombinacji wystających sekwencji.
Rysunek 01: Złota Brama
Procedura montażu Złotej Bramy
Technika Złotej Bramy składa się z trzech głównych kroków w swojej procedurze:
- tworzenie nawisów w wektorze klonującym,
- montaż wielu wstawek DNA przy użyciu sekwencji specyficznych dla fragmentu w nawisach, oraz
- ligacja.
Montaż Golden Gate wykorzystuje okrągłe wektory klonowania (wektor docelowy). Ponadto, w tym sposobie, miejsce restrykcyjne jest eliminowane z ligowanego produktu w celu jednoczesnego przeprowadzenia trawienia i ligacji. Typowy protokół cyklu termicznego dla Golden Gate oscyluje między 37 °C a 16 °C, ponieważ 37 °C jest optymalny dla enzymów restrykcyjnych, a 16 °C jest optymalny dla ligaz.
Co to jest zespół Gibsona?
Gibson Assembly to molekularna metoda klonowania, która umożliwia połączenie wielu fragmentów DNA w jeden element. W przeciwieństwie do metody Golden Gate, ta metoda nie opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana. Został znaleziony przez Daniela G. Gibsona z Instytutu J. Craiga Ventera. Ta technika jest rodzajem metody klonowania niezależnego od sekwencji i ligazy (SLIC).
Rysunek 02: Zespół Gibsona
Procedura montażu Gibsona
Gibson Assembly potrzebuje fragmentów DNA zawierających 20-40 par zasad nakładających się na sąsiednie fragmenty DNA. Zakładki są dodawane za pomocą PCR. Następnie te fragmenty DNA są dodawane do mieszaniny maser Gibsona, która ma trzy enzymy. Procedurę tę przeprowadza się w warunkach izotermicznych (50°C przez 1 godzinę) przy użyciu trzech różnych enzymów: egzonukleazy, polimerazy DNA i ligazy DNA. Egzonukleaza przeżuwa DNA z końca 5’. Dzięki temu nie hamuje aktywności polimerazy i pozwala na zachodzenie reakcji w jednym procesie. Powstałe jednoniciowe regiony na sąsiednich fragmentach DNA można sparować ze względu na nakładające się sekwencje. Polimeraza DNA wypełnia luki poprzez dodanie nukleotydów. Wreszcie ligaza DNA łączy się kowalencyjnie z DNA sąsiednich segmentów. Zwykle Gibson Assembly używa linearyzowanych wektorów docelowych. Co więcej, ta metoda może jednocześnie łączyć do 15 fragmentów DNA w oparciu o podobieństwo sekwencji.
Podobieństwa między Golden Gate i Gibson Assembly
- Golden Gate i Gibson Assembly to dwie metody klonowania molekularnego.
- Obie metody mogą połączyć wiele fragmentów DNA w jeden element.
- Te metody wykorzystują wektory docelowe.
- Obie metody wykorzystują termocyklery do składania wielu fragmentów DNA.
- Są używane w mutagenezie ukierunkowanej.
Różnica między Golden Gate a Gibson Assembly
Golden Gate to molekularna metoda klonowania stosowana do łączenia wielu fragmentów DNA w jeden fragment, polegająca na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana, podczas gdy Gibson Assembly to molekularna metoda klonowania stosowana w składanie wielu fragmentów DNA w jeden kawałek bez polegania na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana. To jest kluczowa różnica między Golden Gate a Gibson Assembly. Co więcej, metoda Golden Gate wykorzystuje kołowy wektor docelowy, podczas gdy metoda Gibson Assembly używa linearyzowanego wektora docelowego.
Poniższa infografika przedstawia różnicę między Golden Gate a Gibson Assembly.
Podsumowanie – Golden Gate vs Gibson Assembly
Klonowanie molekularne to metoda stosowana do składania rekombinowanych cząsteczek DNA i kierowania ich replikacją w organizmach gospodarza. Golden Gate i Gibson Assembly to dwie metody klonowania molekularnego, które umożliwiają połączenie wielu fragmentów DNA w jeden element. Metoda Golden Gate opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana, podczas gdy Gibson Assembly nie opiera się na obecności miejsc restrykcyjnych w określonej sekwencji, która ma być sklonowana. Jest to więc kluczowa różnica między Golden Gate a Gibson Assembly.
