Kluczowa różnica – ligacja tępych i lepkich końcówek
Endonukleazy restrykcyjne to specyficzne enzymy, które tną dwuniciowy DNA (dsDNA). Są one również znane jako nożyczki molekularne w biologii molekularnej. Enzymy restrykcyjne są zdolne do rozpoznawania określonych krótkich sekwencji dsDNA znanych jako miejsca rozpoznawania i rozszczepiania wiązań fosfodiestrowych i wodorowych w celu otwarcia podwójnych nici. W wyniku cięcia przez te enzymy powstają fragmenty DNA z różnymi typami końców, takimi jak końce lepkie i końce tępe. Ligaza DNA to enzym stosowany w biologii molekularnej do łączenia dwóch sąsiednich nici DNA poprzez tworzenie nowych wiązań. Etap ten jest znany jako ligacja i zgodnie z rodzajem ligowanego końca DNA można go określić jako ligację tępych końców i ligację lepkich końców. Kluczową różnicą między ligacją tępych i lepkich końców jest to, że ligacja tępych końców występuje między fragmentami DNA, które zawierają dwa tępe końce, podczas gdy ligacja lepkich końców występuje między nawisami 5' i 3'. W porównaniu z ligacją na tępe końce, podwiązanie za pomocą kleju jest bardziej wydajne i stabilne.
Co to jest podwiązanie tępego końca?
Niektóre endonukleazy restrykcyjne mogą ciąć DNA na przeciwnych zasadach i wytwarzać fragmenty DNA o tępych końcach. Enzymy te są znane jako obcinacze tępych końców; rozszczepiają się prosto w dół do środka miejsca restrykcyjnego bez pozostawiania jednoniciowych zwisających zasad. Tępe końce są również znane jako nie wystające, ponieważ nie mają wystających podstaw 3 ' i 5 ' na końcach. Obie nici kończą się od par zasad tępymi końcami. Powszechnymi enzymami tnącymi na tępe końce są EcoRV HaeIII, AluI i SmaI.
Podwiązanie tępych końców zachodzi pomiędzy dwoma tępymi końcami. Nie jest to podwiązanie wystających podstaw. Takie podwiązanie jest mniej wydajne niż podwiązanie końcówek samoprzylepnych. Jednak w niektórych przypadkach ligacja tępych końców staje się bardziej korzystna niż ligacja lepkich końców, zwłaszcza podczas ligacji produktów PCR. Produkty PCR są zawsze produkowane z tępymi końcami. Ligacja tępych końców nie wymaga komplementarnych końców DNA do ligacji.
Rysunek 01: Produkcja tępych końców przez enzym Eco RV
Co to jest podwiązanie przyklejonych końcówek?
Niektóre endonukleazy restrykcyjne są zdolne do cięcia dsDNA, pozostawiając na końcu wystający kawałek jednoniciowego DNA. Te końce są znane jako lepkie lub zwisające końce. Ligacja lepkich końców zachodzi między dwoma fragmentami DNA, które zawierają pasujące nawisy, ponieważ lepkie końce mają niesparowane zasady i wymagają komplementarnych zasad, aby utworzyć wiązania. Dlatego konieczne jest użycie tego samego enzymu restrykcyjnego dla obu źródeł DNA w celu wytworzenia pasujących fragmentów ligujących.
Podwiązanie zakończeń lepkich jest bardziej wydajne i często bardzo pożądane w procesach klonowania. Istnieje kilka enzymów restrykcyjnych, które wytwarzają lepkie końce. Są to EcoRI, BamHI, HindIII itp.
Rysunek 02: Produkcja lepkiego końca przez enzym Eco RI
Jaka jest różnica między podwiązaniem tępym a lepkim?
Podwiązanie tępe kontra lepkie |
|
| Ligacja tępych końców występuje pomiędzy dwoma fragmentami DNA tępych końców. | Ligacja lepkich końców występuje między dwoma pasującymi fragmentami DNA z lepkimi końcami. |
| Enzymy | |
| Obcinaki z tępymi końcami powodują tępe końce. | Obcinaki do końcówek lepkich wytwarzają lepkie lub spoiste końce. |
| Wymaganie pasujących końców | |
| Nie wymaga dopasowywania fragmentów ani komplementarnych zasad. | Wymaga komplementarnych zasad na końcach, aby utworzyć pary zasad. |
| Wydajność | |
| Jest mniej wydajny niż podwiązanie za pomocą kleju | Jest bardziej wydajny niż podwiązanie na tępe końce. |
Podsumowanie – Podwiązanie tępe kontra lepkie
Endonukleazy restrykcyjne są w stanie ciąć dsDNA i wytwarzać fragmenty DNA o różnych końcach. Rozpoznają określone sekwencje i ograniczają DNA, tworząc lepkie i tępe końce. Lepkie końce mają niesparowane podstawy na końcach fragmentów. Tępe końce powstają dzięki prostemu dekoltowi i mają na końcach pary zasad. Ligacja lepkich końców wymaga dwóch komplementarnych jednoniciowych fragmentów DNA. Ligacja tępych końców zachodzi pomiędzy dowolnymi dwoma fragmentami tępych końców. To jest różnica między ligacją tępą a lepką.
