Kluczowa różnica – RT PCR vs QPCR
Reakcja łańcuchowa polimerazy to technika stosowana do amplifikacji określonego regionu DNA in vitro. Dzięki wynalezieniu tej techniki przez Kary Mullisa w 1983 roku naukowcy są w stanie wykonać od tysięcy do milionów kopii określonych fragmentów DNA do celów badawczych. Obecnie stała się powszechną i rutynowo wykonywaną techniką w laboratoriach klinicznych i badawczych o szerokim spektrum zastosowań. Istnieją odmiany tradycyjnej techniki PCR, takie jak RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR itp. RT PCR i Q PCR to dwie ważne odmiany PCR. Kluczową różnicą między RT PCR i Q PCR jest to, że RT PCR służy do wykrywania ekspresji genów poprzez tworzenie komplementarnych transkryptów DNA (cDNA) z RNA, podczas gdy Q PCR służy do ilościowego pomiaru produktów PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwników fluorescencyjnych.
Co to jest RT PCR?
Łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT PCR) jest odmianą PCR, która jest używana do wykrywania ekspresji RNA. Jest to bardzo ważna metoda wykrywania ekspresji mRNA w tkankach. RT PCR stosuje się, gdy materiałem wyjściowym próbki jest RNA. W RT PCR matrycowy mRNA jest najpierw przekształcany w komplementarny DNA. Ten etap jest katalizowany przez enzym odwrotną transkryptazę, a proces ten jest znany jako odwrotna transkrypcja. Po drugie, dla nowo zsyntetyzowanego cDNA do amplifikacji stosuje się tradycyjny PCR.
RT PCR to bardzo czuła technika, która wymaga stosunkowo niewielkiej ilości próbki RNA. RT PCR jest powszechnie stosowany w diagnostyce i oznaczaniu ilościowym gatunków RNA, zwłaszcza wirusów RNA, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności i wirus zapalenia wątroby typu C.
Rysunek 01: Technika RT PCR
Co to jest QPCR?
Ilościowy PCR (QPCR) to wariant PCR, który jest używany do ilościowego pomiaru produktów PCR. Jest również określany jako reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, ponieważ mierzy amplifikację w czasie rzeczywistym przy użyciu maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Jest to odpowiedni sposób określania ilości sekwencji docelowej lub genu obecnego w próbce. Interesującą cechą QPCR jest to, że łączy w jednym kroku zarówno amplifikację, jak i prawdziwą kwantyfikację. Dlatego też potrzebę elektroforezy żelowej w detekcji można wyeliminować techniką QPCR. QPCR wykorzystuje barwniki fluorescencyjne do znakowania produktów PCR podczas reakcji PCR, co ostatecznie prowadzi do bezpośredniej oceny ilościowej. Gdy produkty PCR gromadzą się, sygnały fluorescencyjne również się kumulują i będą mierzone przez maszynę czasu rzeczywistego. QPCR można łączyć z RT PCR. Znany jest jako RT – QPCR lub QRT – PCR i jest uważany za najpotężniejszą, czułą i ilościową metodę wykrywania poziomu RNA w komórkach lub tkankach.
SYBR Green i Taqman to dwie metody stosowane do wykrywania lub obserwowania procesu amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. Metoda SYBR Green jest przeprowadzana przy użyciu barwnika fluorescencyjnego zwanego SYBR green i wykrywa amplifikację poprzez wiązanie barwnika w celu wytworzenia dwuniciowego DNA. Taqman jest przeprowadzany przy użyciu podwójnie znakowanych sond i wykrywa amplifikację poprzez degradację sondy przez polimerazę Taq i uwalnianie fluoroforu, jak pokazano na rysunku 02. Obie metody monitorują postęp procesu amplifikacji i zgłaszają ilość produktu w czasie rzeczywistym.
PCR w czasie rzeczywistym ma szeroki zakres zastosowań, takich jak kwantyfikacja ekspresji genów, analiza mikroRNA i niekodującego RNA, genotypowanie SNP, wykrywanie wariantów liczby kopii, wykrywanie rzadkich mutacji, wykrywanie organizmów modyfikowanych genetycznie, wykrywanie czynników zakaźnych itp.
Rysunek 02: Technika ilościowej PCR
Jaka jest różnica między RT PCR a QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR to technika stosowana do wykrywania ekspresji genów poprzez amplifikację. | QPCR to technika amplifikacji DNA i ilościowej oceny produktów PCR w czasie rzeczywistym. |
| Zaangażowanie enzymu odwrotnej transkryptazy | |
| Odwrotna transkryptaza enzymatyczna jest używana do RT PCR. | Odwrotna transkryptaza enzymatyczna nie jest używana do QPCR. |
| Zastosowanie cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie | |
| Do RT PCR nie są używane barwniki ani sondy znakowane fluorescencyjnie. | Do QPCR używane są barwniki lub sondy znakowane fluorescencyjnie. |
| Kwantyfikacja produktu PCR | |
| O ile nie jest sprzężony z QPCR, RT PCR nie oznacza ilościowo produktu PCR. | QPCR ilościowo mierzy produkt PCR. |
| Materiał początkowy | |
| Materiał wyjściowy to mRNA. | Materiałem wyjściowym jest DNA. |
| Synteza cDNA | |
| Komplementarne DNA jest wytwarzane podczas RT PCR. | Komplementarne DNA nie jest wytwarzane podczas QPCR. |
Podsumowanie – RT PCR vs QPCR
RT PCR i QPCR to dwie wersje tradycyjnego PCR. Technika RT PCR jest wykonywana dla próbek mRNA i jest sterowana odwrotną transkrypcją i produkcją cDNA. QPCR służy do ilościowego oznaczania produktów PCR podczas cykli termicznych PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwników fluorescencyjnych lub znakowanych sond. W QPCR ilość produktu PCR jest reprezentowana przez sygnały fluorescencyjne emitowane przez próbkę. RT PCR jest powszechnie stosowany jako proces amplifikacji, podczas gdy QPCR jest powszechnie stosowany jako proces kwantyfikacji. To jest różnica między RT PCR i QPCR.
