Kluczowa różnica – mikromacierz vs sekwencjonowanie RNA
Transkryptom reprezentuje całą zawartość RNA obecnego w komórce, w tym mRNA, rRNA, tRNA, zdegradowany RNA i niezdegradowany RNA. Profilowanie transkryptomu jest ważnym procesem w celu zrozumienia wglądu w komórki. Istnieje kilka zaawansowanych metod profilowania transkryptomu. Mikromacierz i sekwencjonowanie RNA to dwa rodzaje technologii opracowanych do analizy transkryptomu. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem mikromacierzy i RNA polega na tym, że mikromacierz opiera się na potencjale hybrydyzacji wstępnie zaprojektowanych znakowanych sond z docelowymi sekwencjami cDNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA opiera się na bezpośrednim sekwencjonowaniu nici cDNA za pomocą zaawansowanych technik sekwencjonowania, takich jak NGS. Mikromacierz jest wykonywana z wcześniejszą wiedzą o sekwencjach, a sekwencjonowanie RNA jest wykonywane bez wcześniejszej wiedzy o sekwencjach.
Co to jest mikromacierz?
Mikromacierz to solidna, niezawodna i wysokowydajna metoda wykorzystywana przez naukowców do profilowania transkryptomu. Jest to najpopularniejsze podejście do analizy transkryptów. Jest to tania metoda, która zależy od sond hybrydyzacyjnych.
Technika rozpoczyna się od ekstrakcji mRNA z próbki i konstrukcji biblioteki cDNA z całkowitego RNA. Następnie jest mieszany z wstępnie zaprojektowanymi sondami znakowanymi fluorescencyjnie na stałej powierzchni (matryca punktowa). Sekwencje komplementarne hybrydyzują ze znakowanymi sondami w mikromacierzy. Następnie mikromacierz jest przemywana i przeszukiwana, a obraz jest określany ilościowo. Zebrane dane należy przeanalizować, aby uzyskać względne profile ekspresji.
Zakłada się, że intensywność sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości transkryptów w próbce. Jednak dokładność techniki zależy od zaprojektowanych sond, wcześniejszej znajomości sekwencji i powinowactwa sond do hybrydyzacji. Stąd technologia mikromacierzy ma ograniczenia. Techniki mikromacierzy nie można wykonać z transkryptami o niskiej liczebności. Nie rozróżnia izoform i nie identyfikuje wariantów genetycznych. Ponieważ metoda ta polega na hybrydyzacji sond, pewne problemy związane z hybrydyzacją, takie jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna itp. występują w technice mikromacierzy.
Rysunek 01: Mikromacierz
Co to jest sekwencjonowanie RNA?
Sekwencjonowanie RNA typu shotgun (sekwencja RNA) to niedawno opracowana technika sekwencjonowania całego transkryptomu. Jest to szybka i wysokoprzepustowa metoda profilowania transkryptomu. Bezpośrednio określa ilościowo ekspresję genów i prowadzi do dogłębnego zbadania transkryptomu. Sekwencja RNA nie zależy od wcześniej zaprojektowanych sond lub wcześniejszej znajomości sekwencji. Dlatego metoda sekwencjonowania RNA charakteryzuje się wysoką czułością i możliwością wykrywania nowych genów i wariantów genetycznych.
Metoda sekwencjonowania RNA jest wykonywana w kilku krokach. Całkowity RNA komórki musi zostać wyizolowany i pofragmentowany. Następnie przy użyciu odwrotnej transkryptazy należy przygotować bibliotekę cDNA. Każda nić cDNA musi być zligowana z adaptorami. Następnie zligowane fragmenty muszą zostać zamplifikowane i oczyszczone. Na koniec przy użyciu metody NGS należy przeprowadzić sekwencjonowanie cDNA.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie RNA
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem mikromacierzy a RNA?
Mikromacierz a sekwencjonowanie RNA |
|
| Mikromacierz to solidna, niezawodna metoda o wysokiej przepustowości. | Sekwencjonowanie RNA to dokładna i wysokoprzepustowa metoda. |
| Koszt | |
| To tania metoda. | To kosztowna metoda. |
| Analiza dużej liczby próbek | |
| Ułatwia to analizę dużej liczby próbek jednocześnie. | Ułatwia to analizę dużej liczby próbek. |
| Analiza danych | |
| Analiza danych jest złożona. | W tej metodzie generowanych jest więcej danych; dlatego proces jest bardziej złożony. |
| Wstępna znajomość sekwencji | |
| Ta metoda jest oparta na sondach hybrydyzacyjnych, więc wymagana jest wcześniejsza znajomość sekwencji. | Ta metoda nie zależy od wcześniejszej znajomości sekwencji. |
| Odmiany strukturalne i nowe geny | |
| Ta metoda nie wykrywa zmian strukturalnych i nowych genów. | Ta metoda umożliwia wykrywanie zmian strukturalnych, takich jak fuzja genów, alternatywny splicing i nowe geny. |
| Czułość | |
| Nie wykrywa to różnic w ekspresji izoform, więc ma ograniczoną czułość. | Ma to wysoką czułość. |
| Wynik | |
| Może to skutkować tylko względnymi poziomami wyrażeń. Nie daje to absolutnej oceny ilościowej ekspresji genów. | Daje bezwzględny i względny poziom ekspresji. |
| Ponowna analiza danych | |
| To musi zostać ponownie uruchomione w celu ponownej analizy. | Dane sekwencjonowania mogą być ponownie analizowane. |
| Potrzeba określonego personelu i infrastruktury | |
| Do mikromacierzy nie jest wymagana specjalna infrastruktura i personel. | Konkretna infrastruktura i personel wymagany do sekwencjonowania RNA. |
| Problemy techniczne | |
| Technika mikromacierzy wiąże się z problemami technicznymi, takimi jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona szybkość wykrywania poszczególnych sond itp. | Technika sekwencjonowania RNA pozwala uniknąć problemów technicznych, takich jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona szybkość wykrywania poszczególnych sond itp. |
| Uprzedzenia | |
| Jest to metoda stronnicza, ponieważ zależy od hybrydyzacji. | Odchylenie jest niskie w porównaniu do mikromacierzy. |
Podsumowanie – mikromacierz a sekwencjonowanie RNA
Metody mikromacierzy i sekwencjonowania RNA to wysokowydajne platformy opracowane do profilowania transkryptomu. Obie metody dają wyniki, które są silnie skorelowane z profilami ekspresji genów. Jednak sekwencjonowanie RNA ma przewagę nad mikromacierzą do analizy ekspresji genów. Sekwencjonowanie RNA jest bardziej czułą metodą wykrywania transkryptów o niskiej liczebności niż mikromacierz. Sekwencjonowanie RNA umożliwia również rozróżnienie izoform i identyfikację wariantów genów. Jednak mikromacierz jest powszechnym wyborem większości badaczy, ponieważ sekwencjonowanie RNA jest nową i kosztowną techniką, która wiąże się z wyzwaniami związanymi z przechowywaniem danych i złożoną analizą danych.
