Kluczowa różnica – RAPD vs RFLP
Markery genetyczne są używane w biologii molekularnej do identyfikacji różnic genetycznych między osobnikami i gatunkami. Losowo amplifikowany polimorficzny DNA (RAPD) i polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) to dwa ważne markery molekularne rutynowo stosowane w laboratoriach. RAPD wykonuje się z użyciem krótkich i arbitralnych starterów oligonukleotydowych i opiera się na losowej amplifikacji wielu lokalizacji w matrycy DNA organizmu. RFLP jest przeprowadzana z użyciem specyficznej endonukleazy restrykcyjnej i opiera się na polimorfizmie powstałych fragmentów restrykcyjnych i hybrydyzacji. Kluczowa różnica między RAPL i RFLP polega na tym, że RAPD jest rodzajem techniki PCR wykonywanej bez wcześniejszej znajomości sekwencji, podczas gdy RFLP nie jest zaangażowany w PCR i wymaga wcześniejszej znajomości sekwencji do przeprowadzenia techniki.
Co to jest RAPD?
RAPD jest użytecznym markerem molekularnym w biologii molekularnej. Jest to szybka i łatwa technika. RAPD można zdefiniować jako metodę, w wyniku której powstają polimorficzne sekwencje DNA w wyniku losowej amplifikacji wielu lokalizacji docelowej matrycy DNA. RAPD wykorzystuje krótkie startery oligonukleotydowe o dowolnych sekwencjach do amplifikacji PCR. Startery są sztucznie syntetyzowane bez wcześniejszej znajomości sekwencji. Dlatego jest uważana za łatwą i użyteczną technikę.
W RAPD zaangażowane są następujące główne kroki.
- Ekstrakcja docelowego DNA
- Wzmacnianie wielu lokalizacji docelowego DNA przy użyciu losowo wybranych starterów
- Elektroforeza żelowa amplifikowanych produktów PCR
- Barwienie bromkiem etydyny i identyfikacja polimorfizmu
W wyniku zmienności przyłączania starterów podczas amplifikacji powstają różne fragmenty o różnej długości. W związku z tym wzory prążków na żelach różnią się między osobnikami i gatunkami. W ten sposób RAPD umożliwia wykrywanie zmienności genetycznej wśród organizmów w identyfikacji i różnicowaniu.
RAPD jest stosowany w różnych badaniach biologii molekularnej, takich jak identyfikacja różnic genetycznych między blisko spokrewnionymi gatunkami, mapowanie genów, odciski palców DNA, identyfikacja chorób dziedzicznych itp.
Rysunek 01: RAPD
Co to jest RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) to marker molekularny używany w biologii molekularnej do identyfikacji zmienności genetycznej w homologicznych sekwencjach DNA. Jest to pierwszy marker genetyczny opracowany do pobierania odcisków palców DNA. Wszystkie organizmy wytwarzają unikalne profile DNA, gdy są ograniczone określonymi enzymami restrykcyjnymi. RFLP służy jako ważne narzędzie do tworzenia unikalnych profili DNA osobników i wykrywania zmienności genetycznej wśród nich. Gdy próbki DNA są trawione specyficznymi endonukleazami restrykcyjnymi, uzyskuje się różne profile DNA, które są unikalne dla każdego osobnika. Dlatego zasadniczą zasadą tej metody jest wykrywanie zmienności genetycznej wśród organizmów poprzez restrykcję homologicznego DNA specyficznymi enzymami restrykcyjnymi oraz analizę polimorfizmu długości fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej i blottingu. Wzory blottingu są unikalne dla każdego organizmu i charakteryzują określone genotypy.
Z RFLP związane są następujące kroki.
- Izolacja wystarczającej ilości DNA z próbek
- Fragmentacja próbek DNA specyficznymi endonukleazami restrykcyjnymi na krótkie sekwencje
- Oddzielenie powstałych fragmentów o różnej długości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
- Przenoszenie profilu żelu na membranę metodą Southern blotting
- Hybrydyzacja membrany ze znakowanymi sondami i analiza polimorfizmu długości fragmentów w każdym profilu
RFLP ma różne zastosowania, takie jak diagnostyka chorób dziedzicznych, mapowanie genomu, identyfikacja przestępstw w badaniach kryminalistycznych, badanie ojcostwa itp.
Rysunek 02: Genotypowanie RFLP
Jaka jest różnica między RAPD a RFLP?
RAPD a RFLP |
|
| RAPD to marker molekularny oparty na losowych starterach i PCR. | RFLP to marker molekularny oparty na produkcji fragmentów restrykcyjnych o różnej długości. |
| Wymagana próbka | |
| Do analizy RAPD wystarczą małe próbki DNA. | Do analizy RFLP wymagana jest duża ilość wyekstrahowanej próbki DNA. |
| Czas | |
| RAPD to szybki proces. | RFLP to czasochłonny proces. |
| Użycie podkładu | |
| Stosowane są losowe startery i te same startery mogą być używane dla różnych gatunków. | Sondy specyficzne dla gatunku są używane w RFLP do hybrydyzacji. |
| Niezawodność | |
| Niezawodność techniki jest mniejsza w porównaniu z RFLP. | RFLP to niezawodna technika. |
| Blotowanie | |
| RAPD obejmuje Southern blotting. | Southern blotting to jeden z etapów RFLP. |
| Wykrywanie odmiany allelicznej | |
| Odmiany alleliczne nie mogą być wykryte przez RAPD. | Odmiany alleli mogą być wykryte przez RFLP. |
| Potrzeba wiedzy o sekwencjach | |
| RAPD nie wymaga wcześniejszej znajomości sekwencji. | Do projektowania sond wymagana jest wcześniejsza znajomość sekwencji. |
| PCR | |
| PCR jest zaangażowany w RAPD | PCR nie jest związany z RFLP. |
| Odtwarzalność | |
| RAPD ma niską odtwarzalność | RFLP charakteryzuje się wysoką odtwarzalnością w porównaniu z RAPD. |
Podsumowanie – RAPD vs RFLP
RAPD i RFLP to ważne markery stosowane w biologii molekularnej. Obie metody są w stanie wykryć zmienność genetyczną wśród organizmów. RAPD wykonuje się przy użyciu losowych starterów. RFLP przeprowadza się przy użyciu określonych enzymów restrykcyjnych. Obie metody wytwarzają profile DNA unikalne dla poszczególnych organizmów. RAPD obejmuje stosunkowo niewiele kroków niż RFLP. Ale daje mniej wiarygodne i powtarzalne wyniki niż RFLP. To jest główna różnica między RAPD a RFLP.
