Kluczowa różnica – nitroceluloza a PVDF
Western blotting to metoda, która umożliwia wykrywanie i oznaczanie ilościowe określonych białek w próbce białka. Niezawodność techniki zależy od doboru odpowiedniej membrany do absorpcji białek z żelu. Istnieją różne rodzaje membran mikroporowatych. Membrany nitrocelulozowe i PVDF to dwie takie membrany preferowane przez naukowców ze względu na ich specjalne właściwości w porównaniu z innymi typami membran. Wybór pomiędzy nitrocelulozą lub PVDF jest również kolejnym wyzwaniem w western blotting. Zarówno nitroceluloza, jak i PVDF mają wysoką zdolność wchłaniania białek. Kluczowa różnica między membraną nitrocelulozową a membraną PVDF polega na tym, że membrany nitrocelulozowe nie mają zdolności do usuwania przeciwciał i ponownego użycia membrany do ponownego sondowania przeciwciał, podczas gdy membrany PVDF mają zdolność do usuwania i ponownego użycia.
Co to jest nitroceluloza?
Nitroceluloza jest polimerem wytwarzanym przez traktowanie celulozy kwasem azotowym i jest używana do wytwarzania mikroporowatych membran w biologii molekularnej, zwłaszcza do technik blottingu, takich jak Southern, Northern i Western blotting. Rozmiary porów membran nitrocelulozowych wahają się od 3 do 20 µm. Mikroporowate membrany nitrocelulozowe ułatwiają wykrycie reakcji immunochemicznej zachodzącej na powierzchni membrany. Dlatego też membrany nitrocelulozowe są często stosowane do unieruchamiania białek i wykrywania określonych białek w analizie Western blotting. Błony nitrocelulozowe mogą również unieruchamiać glikoproteiny i kwasy nukleinowe.
Membrany nitrocelulozowe są preferowane w testach przepływu bocznego ze względu na kilka cech. Błony nitrocelulozowe absorbują białka w wysokim stężeniu. Rozpuszczalnik użyty do zwilżenia membrany nie zmniejsza absorpcji białek membrany nitrocelulozowej. Membrany nitrocelulozowe można łatwo przyciąć do pożądanego rozmiaru żelu i przenieść białka z żelu na membranę za pomocą transferu elektrycznego lub kapilarnego. Nitroceluloza umożliwia szybszy przepływ białek przez błonę o wysokim potencjale wiążącym. Nitroceluloza wykazuje ulepszoną wytrzymałość manipulacyjną. Inną specjalną cechą membrany nitrocelulozowej jest to, że można ją łatwo przykleić za pomocą nierozpuszczalnikowych, wodoodpornych klejów na różnych podłożach z tworzyw sztucznych.
Rysunek 01: Membrana nitrocelulozowa do Western blotting
Co to jest PVDF?
Polifluorek winylidenu (PVDF) jest fluoropolimerem wytwarzanym przez polimeryzację difluorku winylidenu i ma wysoką zdolność unieruchamiania białek. Dlatego mikroporowate membrany wykonane z PVDF są wykorzystywane w technikach Western blotting do analizy określonych białek z mieszanin białek. Membrany PVDF można również stosować do analizy aminokwasów i sekwencjonowania białek. Najważniejszą cechą membrany PVDF nad membraną nitrocelulozową jest to, że można ją łatwo usunąć z przeciwciał i ponownie wykorzystać do kolejnych sond przeciwciał.
Membrany PVDF są grubsze niż membrany nitrocelulozowe; dzięki temu są bardziej odporne na uszkodzenia podczas ponownego użycia. Membrany PVDF są wysoce hydrofobowe. Dlatego przed użyciem należy je namoczyć w metanolu lub izopropanolu.
Jaka jest różnica między nitrocelulozą a PVDF?
Nitroceluloza a PVDF |
|
| Nitroceluloza to polimer składający się z celulozy. | PVDF to fluoropolimer wytwarzany przez polimeryzację difluorku winylidenu. |
| Rozmiar porów membrany | |
| Typowe rozmiary porów to 0,1, 0,2 lub 0,45 μ | Typowe rozmiary porów to 0,1, 0,2 lub 0,45 μm |
| Zdolność wiązania białek | |
| Nitroceluloza ma zdolność wiązania białek od 80 do 100 μg/cm2. | PVDF ma zdolność wiązania białek od 170 do 200 μg/cm2. |
| Czułość | |
| Ma to niską czułość w porównaniu z PVDF. | Ma to wysoką czułość. |
| Wykrywanie białek o niskiej ekspresji | |
| Ponieważ czułość membran nitrocelulozowych jest niska, nie nadaje się do wykrywania białek o niskiej ekspresji. | Jest to bardziej odpowiednie do wykrywania białek o niskiej ekspresji ze względu na wysoką czułość. |
| Szum w tle | |
| To ma niższy poziom szumów | To ma wyższy poziom hałasu w tle. |
| Interakcje z białkami | |
| Cząsteczki białek wiążą się z błonami nitrocelulozowymi poprzez oddziaływania hydrofobowe. | Białka wiążą się z membranami PVDF poprzez oddziaływania hydrofobowe i dipolowe. |
| Natura membrany | |
| Nitroceluloza jest krucha i krucha. Dostępne są jednak wersje nitrocelulozy, które są odporne. | PVDF jest trwalszy i ma wyższą odporność chemiczną. |
| Możliwość rozebrania i ponownego użycia | |
| Nitroceluloza może mieć trudności z usuwaniem i ponownym sondowaniem bez utraty sygnału. | PVDF jest idealny do aplikacji do ponownego sondowania i sekwencjonowania. |
| Przydatność | |
| Nitroceluloza jest idealna do wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej. | PVDF jest bardziej odpowiedni do wykrywania białek o większej masie cząsteczkowej. |
| Inne zastosowania | |
| Nitroceluloza może być używana do analizy kwasów nukleinowych i blottingu punktowego/szczelinowego. | PVDF może być stosowany do sekwencjonowania białek i systemów testów fazy stałej. |
| Koszt | |
| Jest to tańsze niż membrany PVDF. | Jest to droższe niż membrany nitrocelulozowe. |
| Potrzeba wstępnego zwilżania | |
| Membrany nitrocelulozowe nie wymagają wstępnego namaczania metanolem | Membrany PVDF wymagają wstępnego nasączenia metanolem. |
Podsumowanie – Nitroceluloza kontra PVDF
Membrany nitrocelulozowe były pierwszymi membranami stosowanymi komercyjnie w teście przepływu bocznego. Posiadają dużą zdolność wchłaniania białek. Dlatego w Western blot stosuje się membrany nitrocelulozowe. PVDF to kolejny rodzaj membrany stosowany w western blotting, który ma również wysoką zdolność wchłaniania białek. Oba typy są używane w Western blotting do analizy białek. Jednak membrany PVDF mają więcej specjalnych właściwości, dzięki czemu są bardziej odpowiednie niż membrany nitrocelulozowe do western blotting. Ale membrany nitrocelulozowe są bardziej odpowiednie do wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej, membrany PVDF są bardziej odpowiednie do wykrywania białek o wysokiej masie cząsteczkowej. Taka jest różnica między membranami nitrocelulozowymi a PVDF.
