Kluczowa różnica – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green i Taqman to dwie metody stosowane do wykrywania lub obserwowania procesu amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. SYBR Green jest metodą opartą na interkalowaniu barwnika kwasu nukleinowego, natomiast Taqman jest metodą opartą na sondzie do hydrolizy. Obie technologie mają na celu generowanie fluorescencji podczas PCR, co umożliwia maszynie PCR w czasie rzeczywistym monitorowanie reakcji w „czasie rzeczywistym”. Metoda SYBR Green jest przeprowadzana przy użyciu barwnika fluorescencyjnego zwanego SYBR green i wykrywa amplifikację poprzez wiązanie barwnika z wytworzonym dwuniciowym DNA. Taqman jest przeprowadzany przy użyciu podwójnie znakowanych sond i wykrywa amplifikację poprzez degradację sondy przez polimerazę Taq i uwalnianie fluoroforu. To jest kluczowa różnica między SYBR Green i Taqman.
Co to jest SYBR Green?
SYBR Green to fluorescencyjny barwnik stosowany do barwienia kwasów nukleinowych, zwłaszcza dwuniciowego DNA w biologii molekularnej. Metoda SYBR Green służy do ilościowego oznaczania produktów PCR podczas real-time PCR. Po związaniu się z DNA powstały kompleks DNA-barwnik pochłania światło niebieskie i emituje intensywne światło zielone. Dzieje się tak z powodu zmiany strukturalnej, która zachodzi w cząsteczce barwnika po związaniu z dwuniciowym DNA. Kiedy PCR tworzy coraz więcej DNA, więcej cząsteczek barwnika wiąże się z DNA, generując więcej fluorescencji. Dlatego fluorescencja wzrasta wraz z akumulacją produktu PCR. W związku z tym ilość produktu PCR można zmierzyć ilościowo za pomocą detekcji fluorescencji SYBR Green.
Zielony barwnik SYBR można również stosować do znakowania DNA w cytometrii i mikroskopii fluorescencyjnej. Bromek etydyny został z powodzeniem zastąpiony przez SYBR Green, ponieważ bromek etydyny jest rakotwórczym barwnikiem, który ma problemy z usuwaniem podczas wizualizacji DNA w elektroforezie żelowej.
Istnieją zalety i wady zielonej metody SYBR. Ta metoda jest bardzo czuła, niedroga i łatwa w użyciu. Jednak ze względu na jego zdolność do wiązania się z dowolnym dwuniciowym DNA, niespecyficzne wiązanie może prowadzić do nadmiernej ilościowej oceny produktu PCR.
Rysunek 01: Zielona technika SYBR
Co to jest Taqman?
Taqman to alternatywna dla SYBR Green metoda monitorowania procesu PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta zależy od aktywności egzonukleazy 5’ – 3’ enzymu polimerazy Taq w celu degradacji sond podczas wydłużania nowej nici i uwalniania fluoroforu. W metodzie tej wykorzystuje się sondy podwójnie znakowane i opiera się ona na hydrolizie sond. Sondy to znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy DNA mające fluorescencyjną cząsteczkę reporterową (fluorofor) na końcu 5' i cząsteczkę wygaszacza na końcu 3'. Są one zaprojektowane do wiązania się z jednoniciową matrycą po przeciwnej stronie przyłączenia startera. Polimeraza Taq dodaje nukleotydy do startera i wydłuża nową nić w kierunku podwójnie znakowanych sond. Gdy polimeraza Taq napotka sondę, działanie egzonukleazy polimerazy Taq aktywuje i degraduje sondę. Po zakończeniu syntezy nowej nici sonda poddawana jest całkowitej degradacji i uwalnia fluorofor. Uwolnienie fluoroforu generuje fluorescencję. Cząsteczka fluorescencyjna wygaszacza skutecznie wygasza emitowane światło i tworzy dane wyjściowe do ilościowej oceny produktu PCR. Uwalnianie fluoroforów i ilość produktów PCR są proporcjonalne. Dlatego kwantyfikację można łatwo przeprowadzić metodą Taqmana.
Rysunek 02: Metoda Taqman
Metoda Taqman jest stosowana w PCR w czasie rzeczywistym, oznaczaniu ilościowym ekspresji genów, wykrywaniu polimorfizmów genetycznych, oznaczaniu ilościowym delecji chromosomalnego DNA, identyfikacji bakterii, weryfikacji analizy mikromacierzy, genotypowaniu SNP itp.
Jaka jest różnica między SYBR green a Taqmanem?
SYBR Green kontra Taqman |
|
| Zieleń SYBR oparta jest na barwniku wiążącym DNA. | Taqman zależy od sond hybrydyzacyjnych i aktywności egzonukleazy 5’ do 3’ polimerazy Taq. |
| Sonda fluorescencyjna | |
| Żadne sondy znakowane fluorescencyjnie nie są wymagane. | Wymagane są sondy z podwójnym oznaczeniem. |
| Multipleksowa analiza genów | |
| Nie można go używać do celów genów multipleksowych. | Może być używany do celów multipleksowych genów. |
| Koszt | |
| To jest tańsze. | To jest droższe. |
| Specyfika | |
| Jest to mniej specyficzne i wiąże się z dowolnym dwuniciowym DNA | Są to bardzo specyficzne, ponieważ sondy wykrywają określone produkty amplifikacji. |
| Skuteczność | |
| To jest mniej efektywne. | Jest to bardzo skuteczne. |
| Aplikacja | |
| Wykorzystywane w PCR w czasie rzeczywistym, wizualizacji żelu agarozowego, znakowaniu DNA itp. | Wykorzystywane jest w PCR w czasie rzeczywistym, kwantyfikacji ekspresji genów, wykrywaniu polimorfizmów genetycznych itp. |
Podsumowanie – SYBR Green i Taqman
Taqman i SYBR green to dwie metody stosowane w PCR w czasie rzeczywistym (PCR ilościowa). Obie metody umożliwiają skuteczną ocenę ilościową produktu PCR i opierają się na emisji fluorescencji. Metoda Taqman wykorzystuje podwójnie znakowane sondy do wykrywania nagromadzonego DNA, podczas gdy metoda SYBR Green wykorzystuje barwnik fluorescencyjny. Obie te metody mają również różne zastosowania w biologii molekularnej.
