Kluczowa różnica – klonowanie a podklonowanie
Klonowanie i subklonowanie to procedury biologii molekularnej, które tworzą genetycznie identyczne komórki lub organizmy niosące interesujące DNA lub gen. Klonowanie to technika polegająca na wstawieniu zainteresowanego genu lub DNA do wektora, jego replikacji w bakterii gospodarza oraz wytworzeniu komórek lub organizmów, które są dokładnymi kopiami składu genetycznego. Subklonowanie to technika, która obejmuje wstawienie genu będącego przedmiotem zainteresowania, który jest już wstawiony do wektora, do wektora wtórnego, jego replikację w bakterii gospodarza i wytwarzanie genetycznie identycznych kopii komórek lub organizmów. Kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem polega na tym, że podczas klonowania gen będący przedmiotem zainteresowania, po zligowaniu z wektorem, kontynuuje proces klonowania, podczas gdy podczas subklonowania już sklonowany gen będący przedmiotem zainteresowania jest oddzielany od wektora macierzystego i ponownie wstawiany do wektor odbiorcy i kontynuuj proces.
Co to jest klonowanie?
Klonowanie to procedura, dzięki której powstają organizmy lub komórki identyczne genetycznie. W naturze klonowanie odbywa się za pomocą rozmnażania bezpłciowego. Gdy nie ma rekombinacji lub zmiany genetycznej, komórki potomne otrzymują ten sam skład genetyczny co rodzic. Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne tworzą klony przez podział binarny, pączkowanie, mitozę itp. W biologii molekularnej klonowanie genów lub określonych fragmentów DNA jest popularną metodą badania struktury i funkcji tego konkretnego odcinka DNA.
Głównym celem klonowania molekularnego jest stworzenie milionów kopii genetycznie identycznych komórek lub organizmów zawierających interesujący fragment DNA (głównie geny). Tworzy organizmy z dokładnymi genetycznymi kopiami innego. Przede wszystkim w badaniach molekularnych klonuje się określone geny w celu uzyskania informacji strukturalnych i funkcjonalnych oraz do sekwencjonowania DNA. Klonowanie jest również szeroko stosowane do produkcji określonych białek lub produktów na dużą skalę.
Procedura klonowania
Podstawowe kroki procedury klonowania są następujące.
- Identyfikacja i izolacja interesującego genu. (amplifikacja interesującego genu metodą PCR).
- Trawienie restrykcyjne genu będącego przedmiotem zainteresowania (endonukleaza restrykcyjna wycina gen).
- Trawienie restrykcyjne DNA wektora. (Wektorowe DNA jest również cięte przy użyciu tej samej endonukleazy restrykcyjnej).
- Wstawienie genu do wektora i utworzenie rekombinowanej cząsteczki.
- Transformacja zrekombinowanego wektora w bakterię gospodarza.
- Izolacja i identyfikacja stransformowanych bakterii (wektor plazmidowy powinien zawierać gen selekcyjny, najczęściej gen oporności na antybiotyk do badania przesiewowego stransformowanych bakterii).
- Rekombinowana ekspresja genów w organizmie gospodarza.
Figura_01: Procedura klonowania
Co to jest subklonowanie?
Subklonowanie to procedura przenoszenia interesującego genu z jednego wektora do innego wektora, aby zobaczyć ekspresję genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu. W tej metodzie zaangażowane są dwa wektory; mianowicie wektor macierzysty i wektor docelowy. Sklonowane inserty są ponownie przenoszone do drugiego wektora w subklonowaniu. Celem przeniesienia genu z pierwszego wektora do drugiego wektora jest uzyskanie czegoś, czego nie mógłby zrobić pierwszy wektor lub ponowne oddzielenie genu w już sklonowanym fragmencie DNA i ekspresja go samodzielnie. Na początku w tej procedurze stosuje się enzymy restrykcyjne.
Procedura subklonowania
Podstawowe kroki subklonowania są następujące.
- Za pomocą endonukleaz restrykcyjnych oddzielenie interesującego DNA w plazmidzie donorowym (wektor macierzysty).
- Wzmacnianie interesującego DNA przy użyciu PCR.
- Oczyszczanie produktu PCR (DNA będącego przedmiotem zainteresowania) za pomocą elektroforezy żelowej.
- Otwarcie plazmidu biorcy przez te same endonukleazy restrykcyjne używane do oddzielenia interesującego DNA w plazmidzie rodzicielskim.
- Ligacja interesującego DNA (genu) z plazmidem biorcy w celu utworzenia subklonowanego plazmidu.
- Transformacja subklonowanego wektora do kompetentnej bakterii gospodarza.
- Przesiewanie transformowanych komórek.
- Oczyszczanie plazmidowego DNA i użycie do sekwencjonowania DNA lub ekspresji genów w celu uzyskania pożądanych produktów.
Subklonowanie jest przeprowadzane przy okazji wyizolowania jednego genu ze sklonowanej grupy genów lub gdy gen będący przedmiotem zainteresowania jest wymagany do przeniesienia do użytecznego plazmidu, aby zobaczyć dokładną funkcję genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Figure_02: Procedura subklonowania
Jaka jest różnica między klonowaniem a subklonowaniem?
Klonowanie kontra subklonowanie |
|
| Klonowanie to procedura, która wytwarza genetycznie identyczne organizmy lub komórki. | Subklonowanie to procedura przenoszenia interesującego genu z jednego wektora do innego wektora, aby zobaczyć ekspresję genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu. |
| Proces | |
| Oddziel DNA będące przedmiotem zainteresowania od organizmu i wstaw je do wektora raz i sklonuj | Już sklonowane DNA zostało oddzielone od pierwszego wektora, wstawione do drugiego wektora i sklonowane. |
| Wstaw ruch za pomocą wektorów | |
| Nie przenosi wstawek (DNA będącego przedmiotem zainteresowania) z jednego wektora do innego wektora. | Przenieś wstawki z wektora macierzystego do wektora docelowego. |
Podsumowanie – Klonowanie kontra subklonowanie
Klonowanie tworzy genetycznie identyczne komórki lub organizmy z wstawionym genem lub DNA będącym przedmiotem zainteresowania. Przebiega przez oddzielenie i wstawienie DNA będącego przedmiotem zainteresowania do wektora i ekspresję w bakterii gospodarza. Subklonowanie przebiega podobnie jak klonowanie. Jednak podczas subklonowania już sklonowany fragment DNA (gen będący przedmiotem zainteresowania) jest wstawiany do wektora i transformowany do bakterii gospodarza. To jest kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem.
