Kluczowa różnica – klonowanie genów a PCR
Synteza wielu kopii DNA z określonego fragmentu DNA nazywana jest amplifikacją DNA. Istnieją dwa główne procesy amplifikacji DNA, a mianowicie klonowanie genów i PCR. Kluczową różnicą między klonowaniem genów a PCR jest to, że klonowanie genów wytwarza wiele kopii określonego genu in vivo poprzez konstruowanie rekombinowanego DNA i wzrost wewnątrz bakterii gospodarza, podczas gdy PCR wytwarza miliony kopii określonego fragmentu DNA in vitro, przechodząc powtarzające się cykle denaturacja i synteza.
Co to jest klonowanie genów?
Klonowanie genów to technika wykorzystywana do lokalizowania i namnażania określonego genu z wyekstrahowanego genomowego DNA organizmu poprzez konstrukcję zrekombinowanego DNA. Genomowy DNA zawiera tysiące różnych genów zakodowanych dla białek. Kiedy DNA jest ekstrahowane, zawiera wszystkie możliwe geny, które może nieść. Technika klonowania genów umożliwiła wykrycie konkretnego genu z całego DNA. Dlatego klonowanie genów służy jako ważne narzędzie w biologii molekularnej.
Stworzenie biblioteki genomowej organizmu jest niezbędne w klonowaniu genów, jeśli nie ma pojęcia o lokalizacji odpowiedniego genu w DNA. Bibliotekę genomową tworzy się w następujących krokach.
Krok 1: Ekstrakcja całego DNA z organizmu, który zawiera pożądany gen.
Krok 2: Trawienie restrykcyjne wyekstrahowanego DNA w celu wytworzenia małych, nadających się do zarządzania fragmentów. Ten etap ułatwiają endonukleazy restrykcyjne.
Krok 3: Wybór odpowiedniego wektora i otwarcie wektora DNA przy użyciu tych samych endonukleaz restrykcyjnych. Plazmidy bakteryjne są powszechnie stosowane jako wektory do przenoszenia obcego DNA. Plazmidy to małe kręgi DNA znajdujące się w bakteriach.
Krok 4: Połączenie DNA wektora i pofragmentowanego DNA w celu wytworzenia rekombinowanej cząsteczki DNA. Ten krok jest zarządzany przez ligazę DNA.
Krok 5: Przeniesienie rekombinowanych cząsteczek DNA do bakterii gospodarza. Ten etap jest znany jako transformacja i jest wykonywany przy użyciu szoku cieplnego.
Krok 5: Badanie przesiewowe transformowanych komórek bakteryjnych na pożywce hodowlanej. Mieszaną populację transformowanych i nietransformowanych komórek gospodarza otrzymuje się pod koniec procesu transformacji. Jako gen będący przedmiotem zainteresowania obejmuje tylko transformowane komórki gospodarza. Dlatego konieczna jest selekcja transformowanych komórek. Selekcji dokonuje się przy użyciu pożywek selektywnych zawierających antybiotyki. Tylko transformowane komórki rosną na tej pożywce przesiewowej umożliwiającej selekcję.
Krok 6: Hodowla bakterii w celu stworzenia biblioteki genów. Na tym etapie stransformowane komórki gospodarza są wprowadzane do świeżej pożywki hodowlanej, która zapewnia optymalne wymagania wzrostu. Całkowita liczba kolonii na płytkach hodowlanych reprezentuje bibliotekę genomową tego organizmu.
Krok 7: Rekombinowana cząsteczka DNA zawierająca interesujący gen musi zostać przeszukana z tysięcy sklonowanych fragmentów rekombinowanego DNA. Można to osiągnąć za pomocą sond, które znakują konkretny gen lub konkretne białko wynikające z tego genu.
Gdy zainteresowany gen zawierający kolonię bakteryjną zostanie zidentyfikowany z wszystkich kolonii, możliwe jest wykonanie milionów kopii rekombinowanego plazmidu zawierającego ten gen.
Klonowanie genów jest wykorzystywane do tworzenia bibliotek genów, produkcji specjalnych białek, witamin, antybiotyków, hormonów, sekwencjonowania i mapowania genomów organizmów, tworzenia wielu kopii DNA poszczególnych osób w kryminalistyce itp.
Rysunek_1: Klonowanie genów
Co to jest PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika, która generuje dużą liczbę kopii określonego fragmentu DNA. Wykładniczą amplifikację określonej sekwencji DNA uzyskuje się metodą PCR w warunkach in vitro. Ta technika jest bardzo potężnym narzędziem w biologii molekularnej, ponieważ może rozmnożyć małą próbkę DNA w użyteczną ilość. PCR został wprowadzony przez Kary Mullisa w 1983 roku, a ten nagrodzony wynalazek stworzył ogromny postęp w biologii molekularnej.
Technika PCR podąża za powtarzanymi reakcjami PCR, jak pokazano na Rysunku 02. Jedna reakcja PCR składa się z trzech głównych etapów występujących w trzech różnych temperaturach; denaturacja dwuniciowego DNA w 94 0C, przyłączanie starterów w 68 0C i wydłużenie nici w 72 0 C. Dlatego, gdy przeprowadza się PCR, wahania temperatury powinny być bardzo utrzymywane w celu prawidłowej replikacji. PCR jest przeprowadzany w maszynie do PCR wewnątrz probówek do PCR. Probówki do PCR są ładowane odpowiednimi mieszaninami PCR zawierającymi matrycę DNA, polimerazę Taq, startery, dNTP i bufor. Denaturacja dwuniciowego DNA próbki do jednoniciowego DNA odbywa się poprzez zerwanie wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami w 94 – 98 0C. Następnie pojedyncze nici matrycowego DNA są eksponowane na startery. Należy zapewnić parę starterów (przedniego i wstecznego), które powinny być termostabilne, aby tolerować wysokie temperatury. Startery są jednoniciowymi krótkimi sekwencjami DNA komplementarnymi do końców docelowego fragmentu DNA. W PCR stosuje się startery syntetyczne. Startery wiążą się z komplementarnymi zasadami próbki DNA i inicjują syntezę nowej nici. Ten etap jest katalizowany przez enzym zwany polimerazą Taq; termostabilny enzym polimerazę DNA wyizolowany z Thermus auqaticus. Gdy dostępne są startery i nukleotydy (bloki budulcowe), polimeraza Taq konstruuje nową nić DNA komplementarną do matrycy DNA. Pod koniec programu PCR zamplifikowany fragment DNA jest obserwowany przy użyciu elektroforezy żelowej. Jeśli wymagana jest dalsza analiza, produkt PCR jest oczyszczany z żelu.
PCR jest bardzo przydatny do diagnozowania i monitorowania chorób genetycznych i nabytych, identyfikacji przestępców (w dziedzinie medycyny sądowej), badania struktury i funkcji docelowego segmentu DNA, sekwencjonowania i mapowania genomów organizmów, itp. PCR stał się rutynową techniką laboratoryjną w laboratoriach medycznych i biologii molekularnej wśród naukowców, ponieważ ma wiele zastosowań.
Rysunek_2: Reakcja łańcuchowa polimerazy
Jaka jest różnica między klonowaniem genów a PCR?
Klonowanie genów a PCR |
|
| Klonowanie genów to proces tworzenia wielu kopii określonego genu in vivo poprzez rekombinację DNA i transformację w bakterię gospodarza. | Technika PCR wytwarza wiele kopii określonej sekwencji DNA in vitro poprzez powtarzane cykle reakcji PCR. |
| Wymaganie konstruowania zrekombinowanego DNA | |
| Zrekombinowane DNA jest produkowane w celu zlokalizowania genu. | Rekombinowany DNA nie jest produkowany. |
| Potrzeba pracy | |
| Ten proces jest pracochłonny. | Intensywna praca nie jest potrzebna. |
| Proces in vivo lub in vitro | |
| Konstruowanie rekombinowanego DNA odbywa się in vitro, a amplifikacja DNA in vivo. | Wzmacnianie DNA odbywa się całkowicie in vitro. |
Podsumowanie – Klonowanie genów kontra PCR
Klonowanie genów i PCR to dwie metody stosowane do amplifikacji DNA. PCR to proces in vitro, który tworzy wiele kopii DNA określonego fragmentu DNA bez użycia rekombinowanego DNA i organizmu gospodarza. Klonowanie genów jest przede wszystkim procesem in vivo, w wyniku którego w organizmie gospodarza powstaje wiele kopii interesującego genu poprzez konstrukcję zrekombinowanego DNA. To jest różnica między klonowaniem genów a PCR.
