Kluczowa różnica – PCR vs sekwencjonowanie DNA
PCR i sekwencjonowanie DNA to dwie ważne techniki w biologii molekularnej. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to proces, który tworzy dużą liczbę kopii fragmentu DNA. Sekwencjonowanie DNA to technika, która pozwala uzyskać dokładną kolejność nukleotydów danego fragmentu DNA. To jest kluczowa różnica między sekwencjonowaniem PCR i DNA. PCR jest jednym z głównych etapów sekwencjonowania DNA.
Co to jest PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika amplifikacji DNA stosowana w biologii molekularnej. Wytwarza od tysięcy do milionów kopii określonego fragmentu DNA. Metodę tę opracował Kary Mullis w 1983 roku. W tej technice fragment DNA do amplifikacji służy jako matryca, a enzym polimeraza DNA dodaje komplementarne nukleotydy do startera, który jest dostępny w mieszaninie PCR. Pod koniec reakcji PCR, wiele kopii próbki DNA jest syntetyzowanych.
Istnieją różne składniki mieszaniny PCR, w tym DNA, polimeraza DNA (polimeraza Taq), startery (startery przedni i wsteczny), nukleotydy (elementy budulcowe DNA) i bufor. PCR zachodzi w maszynie do PCR i należy załadować do niej odpowiednią mieszaninę PCR i uruchomić odpowiedni program. Ta technika umożliwia produkcję od tysięcy do milionów kopii określonej sekcji DNA z bardzo małej ilości DNA.
Reakcje PCR zachodzą w sposób cykliczny, aby wytworzyć widoczną ilość produktów PCR na żelu. W reakcji PCR występują trzy główne etapy, a mianowicie denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie nici, jak pokazano na Rysunku 01. Te trzy etapy zachodzą w trzech różnych temperaturach. DNA istnieje w postaci dwuniciowej przez wiązania wodorowe między komplementarnymi zasadami. Przed implikacją należy oddzielić od siebie dwuniciowe DNA. Odbywa się to poprzez nadanie wysokiej temperaturze. W wysokiej temperaturze dwuniciowy DNA ulega denaturacji w pojedyncze nici. Następnie startery powinny zbliżyć się do flankujących końców określonego fragmentu lub genu DNA. Primer to krótki fragment jednoniciowego DNA, który jest komplementarny do sekwencji docelowej. Startery przedni i wsteczny hybrydyzują z komplementarnymi zasadami na flankujących końcach zdenaturowanego DNA próbki w temperaturze hybrydyzacji. Podkłady powinny być odporne na ciepło. Po połączeniu starterów z próbką DNA, enzym polimeraza taq inicjuje syntezę nowych nici poprzez dodanie nukleotydów, które są komplementarne do docelowego DNA. Polimeraza Taq jest termicznie stabilnym enzymem wyizolowanym z termofilnej bakterii zwanej Thermus aquaticus. Bufor PCR utrzymuje optymalne warunki dla działania polimerazy taq. Te trzy etapy reakcji PCR są powtarzane w celu wytworzenia wymaganej ilości produktu PCR. Po każdej reakcji PCR liczba kopii DNA jest podwajana. Stąd w reakcji PCR można zaobserwować wykładniczą amplifikację. Produkty PCR można obserwować za pomocą elektroforezy żelowej i można je oczyścić do dalszych badań.
Rysunek 01: Główne etapy reakcji PCR
PCR to cenne narzędzie w badaniach medycznych i biologicznych. PCR ma szczególną wartość w kryminalistyce, ponieważ może amplifikować DNA do badań z maleńkich próbek od przestępców i tworzyć kryminalistyczne profile DNA. PCR jest szeroko stosowany w wielu obszarach biologii molekularnej, w tym w genotypowaniu, klonowaniu genów, wykrywaniu mutacji, sekwencjonowaniu DNA, mikromacierzach DNA i testowaniu ojcostwa itp.
Rysunek 02: Reakcja łańcuchowa polimerazy
Co to jest sekwencjonowanie DNA?
Sekwencjonowanie DNA to określenie dokładnej kolejności nukleotydów – adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy w danym fragmencie DNA. Informacje genetyczne są przechowywane w sekwencjach DNA przy użyciu właściwej kolejności nukleotydów. Dlatego znalezienie dokładnej kolejności nukleotydów we fragmencie DNA jest bardzo ważne, aby wiedzieć o strukturze i funkcji genów.
Protokół sekwencjonowania DNA obejmuje różne procesy. Pierwszym krokiem jest izolacja zainteresowanego DNA lub genomowego DNA organizmu. Stosując PCR (jak opisano powyżej), należy zamplifikować pożądany region DNA. Zamplifikowany produkt PCR powinien zostać oddzielony przez elektroforezę żelową i oczyszczony. Amplifikowane fragmenty służą jako matryce do sekwencjonowania. Sekwencjonowanie można wykonać albo zgodnie z sekwencjonowaniem Sangera, albo metodą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie Sangera wymaga elektroforezy kapilarnej powstałych fragmentów DNA. Prawidłową kolejność nukleotydów można określić za pomocą ręcznego odczytu autoradiografów lub przy użyciu automatycznych sekwenatorów DNA.
Sekwencjonowanie genów przyczyniło się do projektu ludzkiego genomu i ułatwiło mapowanie ludzkiego genomu w 2003 roku. W kryminalistyce sekwencjonowanie DNA umożliwiło identyfikację osób wykazujących unikalne sekwencje DNA i identyfikację przestępców. W medycynie sekwencjonowanie DNA może być wykorzystywane do wykrywania genów odpowiedzialnych za choroby genetyczne i inne, znajdowania genów defektów i zastępowania ich prawidłowymi genami. W rolnictwie informacje o sekwencjonowaniu DNA niektórych mikroorganizmów są wykorzystywane do produkcji roślin transgenicznych o ekonomicznie pożądanych cechach.
Rysunek 03: Sekwencjonowanie DNA
Jaka jest różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA?
PCR a sekwencjonowanie DNA |
|
| Proces PCR tworzy tysiące do milionów kopii zainteresowanego fragmentu DNA. | Sekwencjonowanie DNA to proces określania dokładnej kolejności nukleotydów w danym fragmencie DNA. |
| Wynik | |
| PCR tworzy od tysięcy do milionów kopii określonego fragmentu DNA | Powoduje to prawidłową kolejność zasad w określonym fragmencie DNA. |
| Zaangażowanie ddNTP | |
| PCR nie wymaga ddNTP. Używa dNTPs. | Sekwencjonowanie DNA wymaga ddNTPs do zakończenia tworzenia nici. |
Podsumowanie – PCR vs sekwencjonowanie DNA
PCR i sekwencjonowanie DNA to bardzo ważne narzędzia w wielu dziedzinach biologii molekularnej. Amplifikację fragmentów DNA wykonuje się techniką PCR, podczas gdy właściwa kolejność nukleotydów fragmentu DNA jest określana przez sekwencjonowanie DNA. To jest różnica między sekwencjonowaniem PCR i DNA.
