Kluczowa różnica – cDNA a biblioteka genomowa
Istnieją dwa główne typy bibliotek DNA skonstruowanych przez naukowców przy użyciu technik inżynierii genetycznej. Są to biblioteka cDNA i biblioteka genomowa. Kluczowa różnica między cDNA a biblioteką genomową polega na tym, że biblioteka cDNA zawiera sklonowany komplementarny DNA całkowitego mRNA organizmu, podczas gdy biblioteka genomowego DNA zawiera sklonowane fragmenty całego genomu organizmu. Biblioteka genomowego DNA jest większa niż biblioteka cDNA.
Co to jest biblioteka genomowa?
Biblioteka genomowego DNA to zbiór klonów zawierających fragmenty całkowitego genomowego DNA organizmu. Zawiera całe genomowe DNA tego organizmu, w tym sekwencje kodujące i niekodujące. Konstrukcję biblioteki genomowej wykonuje się technologią rekombinacji DNA, po której następuje klonowanie (inżynieria genetyczna). Konstrukcja składa się z różnych etapów, jak pokazano na rycinie 01. Proces rozpoczyna się od izolacji genomowego DNA. Stosując odpowiedni protokół ekstrakcji DNA, należy wyizolować całkowite genomowe DNA organizmu. Następnie DNA powinno zostać przekształcone w możliwe do opanowania rozmiary lub w określone fragmenty za pomocą endonukleaz restrykcyjnych (enzymy tnące DNA). Pofragmentowany DNA powinien być wstawiony do wektorów za pomocą ligazy DNA (enzymy łączące DNA). Wektor to samoreplikujący się organizm. Plazmidy i bakteriofagi są powszechnie stosowanymi wektorami w technologii rekombinacji DNA. Te zligowane wektory są znane jako rekombinowane cząsteczki DNA, ponieważ niosą zarówno własne, jak i wstawione sekwencje DNA. Rekombinowane wektory są dodawane do bakterii gospodarza i przygotowywane do pobierania rekombinowanych wektorów wewnątrz komórki bakteryjnej. Bakterie z wektorami rekombinowanymi (plazmidy) powinny być hodowane w pożywce hodowlanej. Podczas namnażania się bakterii bakteryjny DNA wraz ze zrekombinowanymi plazmidami replikuje swoje genomy i wytwarza klony. Klony te zawierają cały genom organizmu źródłowego. Dlatego nazywa się to biblioteką genomową. Plazmidy można łatwo oddzielić od bakteryjnego DNA chromosomalnego w celu skonstruowania biblioteki genomowej tego organizmu. Jeśli dany organizm zawiera zainteresowane geny, łatwo go wykryć w bibliotece genomowej poprzez hybrydyzację przy użyciu sond molekularnych (markerów).
Biblioteki genomowe są ważne dla badania struktury i funkcji genomu, określonych genów, lokalizacji genów, mapowania genów, mutacji, sekwencjonowania genów, identyfikacji nowych genów terapeutycznych itp.
Rysunek_1: Budowa biblioteki genomowej
Co to jest biblioteka cDNA?
Biblioteka cDNA to zbiór komplementarnych klonów DNA (cDNA) zsyntetyzowanych z całkowitego mRNA organizmu. Procedura budowy obejmuje różne etapy. Oczyszczanie całkowitego mRNA z organizmu jest pierwszym etapem. Wyizolowane mRNA są przekształcane w nici cDNA w procesie zwanym odwrotną transkrypcją. Odwrotną transkrypcję ułatwia enzym zwany odwrotną transkryptazą. Wykorzystuje mały starter 3’ i inicjuje syntezę pierwszej nici cDNA komplementarnej do matrycowej nici mRNA. Otrzymany dwuniciowy cDNA jest przekształcany na mniejsze fragmenty przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych i wstawiany do odpowiednich wektorów. Te skonstruowane zrekombinowane cząsteczki są następnie dodawane do organizmu gospodarza i hodowane w pożywce hodowlanej w celu wytworzenia klonów. Zbiór klonów zawierających fragmenty cDNA organizmu jest znany jako biblioteka cDNA. W pełni pokrojone dojrzałe mRNA nie zawiera intronów i regionów regulatorowych. Dlatego niekodujące fragmenty nie są obecne w bibliotekach cDNA w przeciwieństwie do biblioteki genomowej.
Biblioteki cDNA są ważne dla analizy regionów kodujących, funkcji genów, ekspresji genów itp.
Rysunek_2: Budowa biblioteki cDNA
Jaka jest różnica między cDNA a biblioteką genomową?
cDNA a biblioteka genomowa |
|
| Biblioteka cDNA to zbiór klonów niosących DNA komplementarne do mRNA organizmu | Biblioteka genomowa to zbiór klonów niosących całkowite genomowe DNA organizmu. |
| Kodowanie a sekwencje niekodujące | |
| Biblioteka cDNA zawiera tylko sekwencje kodujące; nie zawiera intronów. | Biblioteka genomowa składa się z całego genomowego DNA, w tym niekodującego (intronowego i regulacyjnego) DNA. |
| Rozmiar | |
| Biblioteka cDNA jest mała. | Biblioteka genomowa jest duża. |
| Materiał początkowy | |
| Materiał wyjściowy to mRNA | Materiałem wyjściowym jest DNA. |
| Zaangażowanie w odwrotną transkrypcję. | |
| Odwrotna transkrypcja zachodzi podczas syntezy pierwszej nici cDNA. | Odwrotna transkrypcja nie zachodzi. |
Podsumowanie – cDNA i biblioteka genomowa
Biblioteka genomowa reprezentuje populację klonów niosących pofragmentowany całkowity genomowy DNA organizmu. Biblioteka cDNA reprezentuje populację klonów niosących komplementarny DNA całkowitego mRNA organizmu. Klon cDNA zawiera tylko sekwencje znalezione w mRNA, podczas gdy klon genomowy zawiera sekwencje całego genomu. To jest różnica między cDNA a biblioteką genomową.
