Kluczowa różnica – trypsynizacja na ciepło i na zimno
Trypsynizacja na ciepło i na zimno to dwie metody stosowane w enzymatycznej dezagregacji komórek w hodowli komórek zwierzęcych. Kluczowa różnica między trypsynizacją na ciepło i na zimno, jak sugerują nazwy, zależy od temperatury, w której trypsyna jest dodawana w celu rozbicia komórek. Trypsynizacja na ciepło odbywa się w warunkach wyższej temperatury (36,5 – 37 0C), natomiast trypsynizacja na zimno odbywa się w warunkach niskiej temperatury.
W procesie hodowli pierwotnych komórek zwierzęcych stosowane są trzy główne metody, które okazały się skuteczne. Te trzy metody obejmują mechaniczną dezagregację komórek, enzymatyczną dezagregację komórek i technikę pierwotnej eksplantacji. Enzymatyczna dezagregacja komórek prowadząca do izolacji komórek odbywa się za pomocą enzymu degradującego białko, trypsyny. Dlatego proces ten jest znany jako trypsynizacja. Trypsynizację można przeprowadzić w dwóch różnych warunkach, a mianowicie trypsynizację na ciepło i trypsynizację na zimno. Trypsynizacja na ciepło to metoda traktowania komórek trypsyną w ciepłych warunkach w temperaturze 36,5 – 37 0C. Trypsynizacja na zimno to proces obróbki trypsyną, który odbywa się w chłodniejszych warunkach, najlepiej w lodzie utrzymującym bardzo niskie temperatury.
Co to jest trypsynizacja na ciepło?
Trypsynizację można przeprowadzić w celu rozbicia składników komórkowych w celu wyizolowania komórek w celu wytworzenia pierwotnej hodowli komórkowej. Trypsyna jest enzymem degradacji białka, a mieszanina enzymów stosowana w trypsynizacji może być surowym ekstraktem lub oczyszczonym produktem. Mówi się, że surowy ekstrakt jest bardziej skuteczny w lizie białka i rozpadzie komórek, ponieważ zawiera inne enzymy rozkładające.
Trypsynizacja na ciepło jest najczęściej stosowaną metodą enzymatyczną dezagregacji komórek, która odbywa się w warunkach wyższej temperatury. Przed zabiegiem trypsynizacji pożądaną tkankę kroi się na mniejsze kawałki. Ułatwia łatwy proces dezagregacji. Posiekana tkanka jest następnie myta w specjalnym podłożu znanym jako podłoże Dissection Basal S alt.
Po zakończeniu etapu płukania komórki są przekształcane w kolbę zawierającą aktywny enzym, którym jest trypsyna. Ponieważ technika ta implikuje ciepły protokół trypsynizacji, trypsynę umieszcza się w temperaturze około 37 0C na około cztery godziny.
Rysunek 01: Trypsyna
Zawartość jest mieszana i mieszana przy użyciu metod wirowania w celu ułatwienia protokołu i przyspieszenia procesu dezagregacji. Po osiągnięciu zalecanego czasu komórki można wyprowadzić z supernatantu. Komórki pochodzące z supernatantu są następnie inkubowane w określonej temperaturze i czasie.
Co to jest trypsynizacja na zimno?
Trypsynizacja na zimno to inny rodzaj trypsynizacji, który ma miejsce w zimnych warunkach. W tej technice komórki, które są posiekane i umyte, umieszcza się w fiolkach na lodzie, a następnie moczy w trypsynie. Okres moczenia jest znacznie dłuższy – około 6 – 24 godzin.
Po zakończeniu procedury moczenia, trypsyna jest usuwana z lizatu komórkowego, a kawałki tkanki są dalej inkubowane w temperaturze 370C przez około 20 – 30 minut. Dezagregacja komórek jest powodowana przez powtarzane pipetowanie mieszaniny tkankowej. Umożliwi to komórkom oddzielenie się od błony i przejście do supernatantu. Gdy komórki znajdą się w supernatancie, inkubuje się je i hoduje w pożądanej temperaturze i okresie czasu.
Metoda trypsynizacji na zimno ma kilka zalet
- Większy uzysk żywych komórek, ponieważ uszkodzenie komórek jest zminimalizowane. Uszkodzenie komórek jest zminimalizowane przez niestosowanie etapów wirowania.
- Bardzo wygodna metoda.
- Mniej pracochłonne.
Głównym ograniczeniem metody trypsynizacji na zimno jest to, że duże ilości nie mogą być użyte w jednym przypadku.
Jakie są podobieństwa między trypsynizacją na ciepło i na zimno?
- Zarówno ciepłe, jak i zimne procesy trypsynizacji wykorzystują enzym trypsynę do dezagregacji komórek.
- Procesy trypsynizacji na ciepło i na zimno są stosowane w procedurach hodowli komórkowych do dezagregacji komórek.
- W obu procedurach trypsynizacji na ciepło i na zimno, komórki pochodzą z supernatantu.
Jaka jest różnica między trypsynizacją na ciepło i na zimno?
Trypsynizacja na ciepło i na zimno |
|
| Ciepła trypsynizacja to metoda traktowania komórek trypsyną w ciepłych warunkach w temperaturze 36,5 – 37 0. | Trypsynizacja na zimno to proces obróbki trypsyną, który odbywa się w chłodniejszych warunkach, najlepiej w lodzie utrzymującym bardzo niskie temperatury. |
| Protokół | |
| Pokrojone kawałki tkanki są utrzymywane w temperaturze 37 0C przez cały czas trwania procedury. | Pokrojone kawałki tkanki są początkowo utrzymywane w lodowatych temperaturach, a następnie utrzymywane w temperaturze 37 0. |
| Temperatura | |
| Ciepła trypsynizacja następuje w temperaturze 36,5 – 37 0 | Trypsynizacja na zimno zachodzi w bardzo niskich temperaturach. |
| Czas zużyty | |
| Krótszy czas potrzebny na cały proces (około 4 godzin) trypsynizacji na ciepło. | Dłuższy czas (około 6-24 godzin) do trypsynizacji na zimno. |
| Wydajność żywych komórek | |
| Niska trypsynizacja na ciepło. | Wysoka trypsynizacja na zimno. |
| Zastosowanie wirowania | |
| Odwirowanie jest wymagane do dezagregacji komórek podczas trypsynizacji na ciepło. | W przypadku trypsynizacji na zimno nie jest wymagane wirowanie. |
| Początkowa ilość tkanki do trypsynizacji | |
| Większa ilość tkanki może być użyta do trypsynizacji na ciepło. | Do trypsynizacji na zimno można użyć mniejszej ilości tkanki. |
| Uszkodzenie komórek | |
| Wysokie dzięki wirowaniu w trypsynizacji na ciepło. | Mniej z powodu zimnej trypsynizacji. |
Podsumowanie – Trypsynizacja na ciepło i na zimno
Trypsynizacja to metoda użycia trypsyny, enzymu degradującego białka do dezagregacji i przygotowania pierwotnych kultur komórkowych podczas procesu hodowli komórek. Istnieją dwie główne techniki trypsynizacji oparte na temperaturach stosowanych podczas zabiegu. Są trypsynizacją ciepłą i zimną. Trypsynizację na ciepło przeprowadza się w temperaturze 37 0C, podczas gdy trypsynizację na zimno prowadzi się w warunkach lodowato zimnych. Chociaż trypsynizacja na zimno zajmuje więcej czasu na zakończenie, mówi się, że ma wyższą wydajność żywych komórek. Wynika to z faktu, że w trypsynizacji na zimno minimalizuje się uszkodzenie komórek, ponieważ nie stosuje się energicznych etapów wirowania. To jest różnica między trypsynizacją na ciepło i na zimno.
